1 / 40

九十六年度教育部 「生物及醫學科技人才培育先導型計畫」 基因體與蛋白質體醫學暑期學分班課程表

九十六年度教育部 「生物及醫學科技人才培育先導型計畫」 基因體與蛋白質體醫學暑期學分班課程表. PART II. 主題: 細胞轉染技術與分析 運用流式細胞儀觀察細胞程式性死亡. 課程名稱 : 進階實驗課程 B— 細胞科技實驗              學分數 :1 學分 ( 實驗 ) 負責教師 : 黃昭祥、 楊堉麟 、葉怡玲                         授課時間 :96/08/04, 05, 11, 12 教室 : 尖端生物技術科技人才培育計畫實驗室. 基因表現產物之分析 SEAP: 實驗規劃. 96 well( 一 , 二組 ).

aaralyn
Télécharger la présentation

九十六年度教育部 「生物及醫學科技人才培育先導型計畫」 基因體與蛋白質體醫學暑期學分班課程表

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. 九十六年度教育部「生物及醫學科技人才培育先導型計畫」基因體與蛋白質體醫學暑期學分班課程表九十六年度教育部「生物及醫學科技人才培育先導型計畫」基因體與蛋白質體醫學暑期學分班課程表 PART II • 主題: • 細胞轉染技術與分析 • 運用流式細胞儀觀察細胞程式性死亡 課程名稱: 進階實驗課程B—細胞科技實驗              學分數:1學分(實驗) 負責教師: 黃昭祥、楊堉麟、葉怡玲                         授課時間:96/08/04, 05, 11, 12 教室:尖端生物技術科技人才培育計畫實驗室

  2. 基因表現產物之分析SEAP:實驗規劃

  3. 96 well(一 , 二組)

  4. 96 well(三 , 四組)

  5. 96 well(五 , 六組)

  6. BMP-2基因產物誘導 SEAP基因表現 (本次實驗) BMP2 receptor Signal transduction 訊息誘導出的轉錄因子(蛋白質) BMP-2 基因 SEAP基因 pMyc-SEAP Myc element SEAP 分泌型鹼性磷酸酵素

  7. BMP-2基因產物誘導 SEAP基因表現 (本次實驗) BMP2 receptor Signal transduction 訊息誘導出的轉錄因子(蛋白質) BMP-2 基因 SEAP基因 pMyc-SEAP Myc element SEAP 分泌型鹼性磷酸酵素

  8. 實驗設計用意 • 探討BMP-2基因表現是否可以誘導特定轉錄因子表現。

  9. 轉殖基因表現的分析 SEAP DETECTION SYSTEM

  10. 原理簡介 WHY

  11. WHY 冷光 better than 螢光 ? • LOW BACKGROUND: • HIGH S/N RATIO • HIGH SENSITIVITY (due to above reasons) • EVEN BETTER THAN ISOTOPE Gamma-ray X-ray 冷光 螢光 可見光 偵測波長決定偵測靈敏度 靈敏

  12. Gamma-ray X-ray 冷光 螢光 可見光 偵測波長決定偵測解析度 解析度 0.1mm mm 1nm 0.1nm FMS LMS EMS

  13. Pathway Profiling System Detection system • 一. 材料: • Assay Buffer , chemiluminescent enhancer , 5X Dilution Buffer , 25mM CSPD(冷光受質) • Positive control placental alkaline phosphatase • 二. 試驗前配置的working solution : • 1. 1X Dilution Buffer : 以Mini-Q water 將5X Dilution Buffer做1:5 稀釋 • 2. 1.25mM CSPD Substrate working solution : 將25mM CSPD chemiluminescent substrate與chemiluminescent enhancer做1:19稀釋

  14. 各重要成分介紹

  15. 三. 步驟: • 1. 將15ml sample加到96-well plates的每個well裡 • 2. 再加入45 ml的1X Dilution Buffer至每個sample well中,混合均勻 • 3. 將step 2的diluted sample 在65Oc的水浴漕裡,反應30分鐘 • 4. 反應30分鐘後,再將96-well plate 放在冰上2~3分鐘回溫 • 5. 再加入60ml 的Assay buffer 至每個sample well裡,反應5分鐘 • 6. 再加入60ml的diluted CSPD Substrate 至每個sample well中,反應10分鐘 • 7. 並在step6之後的30分鐘內,以x-ray方式壓片/洗片(定影, 顯影)

  16. Whyheating 65’C

  17. WhyAssay buffer Rx 5 ‘

  18. 結果分析

  19. 預期結果 (第一組為例) 結論? 結論? 結論? 結論? 結論?

  20. 預期結果 (第一組為例 BMP:1ug) (第二組為例 BMP:2ug ) (第三組為例 BMP:4ug ) 結論?

  21. 使用細胞 • NRK: NORMAL RAT KIDNEY (fibroblast cells) • MDCK: MADIN DARBY CANINE KIDNEY (tubule) • M13: MURINE MESANGIAL CELLS

  22. Apoptosis 組別實驗內容規劃 • NRK、NRK+植物萃取物A • NRK+植物萃取物B 、 NRK+H2O2 • NRK+pCMV-BMP2 • M13 、 M13 +BSA • MDCK、MDCK+Mannitol、MDCK+H2O2 • M13 +H2O2

  23. 步驟 • 首先將上清液移至15ml離心管。 • 加入1ml的PBS wash細胞,勿沖洗避免細胞剝落。 • 將上清液移至步驟1的離心管。 • 加入1ml的Tyrpsin在37℃反應5min。 • 加入3ml的PBS將細胞洗下並移到步驟1的離心管。 • 加入3ml的將細胞徹底洗下並移到步驟1的離心管。 • 使用2000 rpm離心細胞5min後,再以同轉數再離心1min。 • 倒去上清液,並可使用200μl的Tip吸乾殘餘的PBS,移入Flow管。 • 加入 100uL染劑, 於RT培養30分鐘, 持續震盪 • 加入200μl的Binding buffer並充分混合均勻。 • 上機分析,分析前請再次混合均勻避免細胞沉澱。 Read FL-1 (Annexin) and FL-2 (PI)

  24. 試劑置備與參數設定 • staining sol’n配製: • 32μl annexin V-FITC + 800 μL binding buffer + 32 μL Propidium iodine(PI) = 600μl • Flow cytometer設定參數 • P1 - FSC Lin • P2 - SSC Lin • P3 – FL-1 (Annexin-V) Log • P4 – FL-2 (PI) Log

  25. Detection of ROS

  26. Introduction 盡可能避光

  27. ROS DETECTION PRINCIPLE H2DCFDA 黃綠螢光 Intracellular Esterase Detect by Flow cytometer Oxidized by ROS

  28. 實驗步驟 1.刺激時間終了後 此盤刺激過的細胞不做任何變動 並加入約50uM/ml(1mM stock solution加100μl至各well)的H2DCF-DA在37℃反應30min。 2. 把上清的medium移到15ml離心管 。 3. 使用2ml PBS wash細胞然後把PBS移到步驟2的離心管。 4. 再加入2ml PBS並在室溫反應10min。 5. 將此PBS移到步驟2。 6. 加入0.5ml trypsin在37℃反應5 min。 7. 然後使用步驟2的離心管內的PBS+Medium的混合液沖洗細胞並移到步驟2。 8. 以2000 rpm 離心5min。 9. 倒去上清液,再加入2 ml PBS並mix細胞,使細胞打散。 10. 再以2000 rpm離心5min。 11. 倒去上清液,然後再加入1 ml Flow cytometer專用的PBS 並混 合均勻。 12. 將步驟11移動到Flow cytometer專用的試管 13.上機分析上機分析,分析前請再次混合均勻避免細胞沉澱。

  29. 實驗組別規劃 第1組 NRK CON+DCFH CON+DCFH CON 植物萃取物A+DCFH 植物萃取物A+DCFH 植物萃取物A+DCFH 植物萃取物A對纖維母細胞氧化壓力的影響

  30. 第2組 NRK CON+DCFH CON+DCFH CON 植物萃取物B+DCFH 植物萃取物B+DCFH 植物萃取物B+DCFH 植物萃取物B對纖維母細胞氧化壓力的影響

  31. 第3組 NRK CON+DCFH CON+DCFH CON pCMV-BMP2 +DCFH pCMV-BMP2 +DCFH pCMV-BMP2 +DCFH BMP-2基因表現對纖維母細胞氧化壓力的影響

  32. 第4組(只做上面一排) M13 CON+DCFH BSA+DCFH CON H2O2 H2O2+DCFH BSA+DCFH H2O2與白蛋白對腎絲球細胞氧化壓力的影響

  33. 第5組 MDCK CON CON+DCFH Mannitol+ DCFH CON Mannitol+ DCFH CON+DCFH 高滲透壓對遠端腎小管細胞氧化壓力的影響

  34. 第6組(只做下面一排) M13 CON+DCFH BSA+DCFH CON H2O2 H2O2+DCFH BSA+DCFH 高H2O2或白蛋白對腎絲球細胞氧化壓力的影響

  35. 預期結果 (增加ROS) (不增加ROS) Control DCFH Treatment +DCFH

More Related