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分子生物学 仪器介绍及应用

分子生物学 仪器介绍及应用. 中心实验室 杨君. 2013.03. 14. 1. 分子 平台仪器概况. 2. 3. Illumina Miseq 测序仪介绍. ５ . 6. 4. 荧光定量 PCR 仪. 多功能酶标仪. 基因枪系统. 内容. 植物活体成像系统介绍. 分子平台仪器. Miseq 测序仪. 植物分子活体成像系统 NightSHADE. 分子平台仪器. Roche LightCycler 480II. THERMOFISHER Varioskan Flash 型全波长扫描多功能读数仪. 分子平台仪器.

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分子生物学 仪器介绍及应用

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Presentation Transcript

  1. 分子生物学仪器介绍及应用 中心实验室 杨君 2013.03. 14

  2. 1. 分子平台仪器概况 2. 3. IlluminaMiseq测序仪介绍 ５. 6. 4. 荧光定量PCR仪 多功能酶标仪 基因枪系统 内容 植物活体成像系统介绍 XTBG

  3. 分子平台仪器 Miseq测序仪 植物分子活体成像系统 NightSHADE

  4. 分子平台仪器 Roche LightCycler 480II THERMOFISHER Varioskan Flash型全波长扫描多功能读数仪

  5. 分子平台仪器 BIO-RAD ChemiDocXRS可见光、 荧光和化学发光成像系统 PERCIVAL LED植物培养箱

  6. 分子平台仪器 Bionano超微量可见紫外 分光光度计 Thermo Fisher 多功能冷冻 离心机 Bio-RAD 梯度PCR仪 岛津可见紫外分光光度计 Tomy-SX500 高压灭菌锅

  7. 分子平台仪器 分子平台仪器共计28台（套） 制冰机 超净工作台 恒温摇床

  8. NightSHADE植物活体分子影像系统

  9. 植物活体成像系统

  10. 植物活体分子成像系统的应用 • 植物活体基因表达 • 植物活体克隆筛选及基因育种筛选 • 植物生物节律研究 • 植物光周期相关研究 • 植物生物光成像 • 植物生长的连续观察 • 药用植物开发 • …… • 推荐文献阅读

  11. 植物基因表达 转录和转录后拟南芥tch4的表达受碰触刺激调控 Plant Physiology vol 130 ,2002, p770-783

  12. 基因工程植物

  13. 基因分离 体外重组 转化 载体构建 转化体 结合常规育种 转基因品种 安全性评价 安全性评价 基因工程植物的主要流程 筛选问题

  14. 基因育种筛选新方法 Promoter Gene X Luciferase Gene transcript mRNA Luciferase X Protein X Luciferase

  15. 活体分子成像基因筛选法 优点

  16. 植物活体克隆筛选 LUC法克隆筛选拟南芥幼苗

  17. 植物生理节律 CAB2启动子的转录 48h后的荧光素酶表达规律 Paul F. Devlin: Signs of the time: environmental input to the circadian clock Journal of Experimental Botany, Vol.53,No.374.pp.1538-1550.July1,2002

  18. 植物生长连续观察 拟南芥（Col- 0）幼苗进行了3天短日照处理条件下，通过暗箱侧面的CCD每4小时成像一次，indiGO软件控制CCD相机拍照及日照和黑暗时间的控制，用来观察胚轴的长度变化

  19. Side mounting of camera 应用- 侧面观察-用于观察容器培养的植物 模式-长期连续测量植物-内部照明

  20. Side mounting of camera Side viewof plant growingchambers

  21. 光周期相关研究

  22. 光周期相关研究

  23. 植物生物光成像 叶片中的叶绿素 枯叶部位生物光信号

  24. 药用植物开发 Expression of Human Nuclear Receptors in Plants for the Discovery of Plant-Derived Ligands ELENA V. DOUKHANINA et.al , 2006

  25. IlluminaMiseq System基因测序分析系统

  26. IlluminaMiseq测序仪应用介绍 • Illumina Technology Overview • MiSeq Introduction • Performance • Applications • 宏基因组16S rDNA单V区测序 • 从头测序(de-novo sequencing) • 转录组测序 • Small RNA测序 • …… Company Logo

  27. IlluminaMiseq测序原理

  28. IlluminaMiseq测序仪简介

  29. 1.宏基因组16S rDNA单V区测序 对16s rRNA的单V区(V3\V4)进行高通量测序，鉴定细菌群和古生菌群,对微生物群落多样性进行分析。

  30. V4区测序示意图

  31. Phylum-level分析结果

  32. 技术路线 环境样品 物理打断（N2、Biorupter-UDC-200） 化学打断（Nextera） DNA提取 基因组DNA 片段化 构建测序文库 IlluminaMiseq测序 数据质控及生物信息学分析

  33. 建库注意事项 Bionano超微量可见紫外分光光度计 Qubit® 2.0 Fluorometer DNA浓度（ ug/ul）input DNA DNA纯度 A260=1.8-2.0

  34. 建库注意事项 Bioanalyzer 2100 Biorupter UDC-200

  35. 2. 基因组de-novo测序 Genomic DNA 从头测序(de-novo sequencing)

  36. 基于Miseq的基因环形分布图

  37. 3. 转录组测序 RNA-seq获得的数据能够进行全面的数据挖掘，既能够进行基因结构分析，鉴定UTR、可变剪切位点，也能够发现新的转录本及非编码RNA，比较样本间的表达水平差异

  38. 4. Small RNA（micro RNAs、siRNAs、piRNAs）测序

  39. 卫 波等，2009.利用高通量测序技术发现植物小分子RNA 研究进展

  40. Roche Lightcycler 480 II荧光定量PCR仪

  41. 基因表达分析的实验流程 核酸纯化 样本制备 逆转录 扩增检测/测序 核酸纯化PCR加样 逆转录/体外转录 匀浆 实时定量PCR 熔解曲线分析 基因测序

  42. 中心实验室基因表达分析平台 qPCR System 样品前处理及实验准备 测序仪 DNA分离、纯化、扩增、检测

  43. Roche 荧光定量PCＲ仪实时PCR检测格式 关于探针的选用请参考网站www.universalprobelibrary.com

  44. 3’ 5’ SG SG SG SG SG Excitation Emission 3’ 5’ Roche 荧光定量PCＲ仪实时定量PCR染料与探针SYBR Green I • SYBR Green I是具有绿色激发波长的染料，能结合于任意dsDNA双螺旋小沟区域 • 信号强度与结合染料的DNA分子数成正比 • 在延伸结束时进行检测

  45. 实时定量PCR染料与探针SYBR Green I 的优势和局限 • 优势 • 对DNA模板没有选择性，适用于任何DNA ，通用性好 • 使用方便 • 不需要设计和合成复杂探针 • 灵敏度高 • 价格便宜 • 局限 • 会与非特异性双链DNA（如引物二聚体）结合，产生假阳性，需要通过后续熔解曲线分析进行产物鉴定 • 对引物特异性要求较高

  46. FRET: 荧光共振能量转移 • FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) • 使用两个荧光标记，一个作为能量供体(Donor)，另一个作为能量受体(Acceptor) 。标记可以是染料，也可以是荧光蛋白，或是TRF标记，如CFP/YFP，FITC/Cy3 等 • 发生FRET的条件： • 供体的发射光谱和受体的激发光谱重叠 • 供体的发射光谱和受体的发射光谱必须分开 • 供体分子与受体分子必须充分接近(1nm-10nm) • 广泛应用于受体-配体、蛋白-蛋白等分子间相互作用的研究

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