1 / 84

Lekciju saraksts

Genoma ekspresijas analīze. Transkriptomika . DNS čipi genomu polimorfisma analīzē. Proteomika un sistēmu bioloģija. Tīklveida struktūras kā bioloģisko sistēmu dabiska sastāvdaļa. Bioinformātikas perspektīvas. Bioinformātika kā priekšnosacījums modernās bioloģijas apgūšanai.

abra
Télécharger la présentation

Lekciju saraksts

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Genoma ekspresijas analīze. Transkriptomika. DNS čipi genomu polimorfisma analīzē. Proteomika un sistēmu bioloģija. Tīklveida struktūras kā bioloģisko sistēmu dabiska sastāvdaļa. Bioinformātikas perspektīvas. Bioinformātika kā priekšnosacījums modernās bioloģijas apgūšanai

  2. Lekciju saraksts Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  3. Gēnu ekspresija profilēšana Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  4. Čipu izgatavošanas fotolitogrāfijas process http://www.affymetrix.com/about_affymetrix/outreach/lesson_plan/downloads/student_manual_activities/activity3/activity3_manufacturing_background.pdf Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  5. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  6. Terminoloģija • RNS, ko hibridizē uz čipa – “target” • Oligonukleotīdi uz čipa – zondes “probes” • Pretēji kā Southern vai Northernhibridizācijās, kur uz membrānas ir “target” genomiskā DNS vai mRNS, kura tiek hibridizēta ar zondi Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  7. Affyčipu parametri • “Feature” – čipa rajons, kas satur noteikta veida zondes • “Feature” izmēri – 11, 18, 20, 24 un 50 mikrometri • “Probeset” – zondes, kas atbilst kādam gēnam • “Probeset” izmēri – 11 PerfectMatchun 11 Mismatch zondes • Zondes garums – 25 nukleotīdi • Maksimālais Probeset skaits 11 mikrometru čipu gadījumā – 61 200 (kopā > 1.3 miljoni zonžu) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  8. Nukleīnskābju hibridizācija Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  9. cRNS iezīmēšana, hibridizācija un detekcija Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  10. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  11. .DAT faili Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  12. .CEL faili Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  13. Affymetrix datu apstrādes plūsma CDF file CHP file Hibridizēts čips DAT file TXT file CEL file Apstrādā attēlu (GCOS) MAS5 (GCOS) Čipuskanē EXP file RPT file Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  14. Ko tad var noteikt ar gēnu ekspresijas čipu? • Kādi gēni ekspresējas noteiktā audu vai šūnu grupā un kāds ir to ekspresijas līmenis? • Kādi gēni ekspresējas atšķirīgi starp dažādām šūnu grupām? • Kādi gēni ekspresējas atšķirīgi starp kontroles un pacientu grupām vienā šūnu tipā? • Kādi gēni parāda līdzīgu ekspresijas līmeni eksperimenta gaitā, kas norāda uz to ko-regulāciju? • Kā izmainās gēnu ekspresija organisma ontoģenēzes laikā? • Kā atšķiras gēnu ekspresija starp dažādiem vienas sugas indivīdiem un starp sugām? Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  15. Tipisks piemērs 1 • Salīdzina gēnu ekspresiju starp diviem šūnu veidiem Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  16. Tipisks piemērs 2 • Salīdzina gēnu ekspresijas izmaiņas pacientam attiecībā pret kontroli Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  17. Tipiski pielietojumi • Medikamentu efekta pētījumi salīdzinot kontroles un testa grupas • Slimību pētījumi salīdzinot kontroles un pacientu grupas • Gēnu ekspresijas salīdzinājums starp dažādiem audiem un šūnām • Gēnu ekspresijas izmaiņas dažādu biotisku un abiotisku faktoru ietekmē Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  18. Tālāki pielietojumi • Gēnu ekspresijas regulācija dažādos audos un orgānos • Ko-regulēti gēni • Gēnu ekspresijas tīklu pētījumi • Ekspresijas čipu pielietojums genotipēšanā un gēnu ekspresijas ģenētikā Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  19. Gēnu koregulācija 4 h 4 h P 6 h 6 h 0 h K 2 h 0 h 2 h Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  20. Gēnu koregulācija Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  21. Gēnu ekspresijas tīkli • Viena gēna ekspresija var ietekmēt citu gēnu ekspresiju gan tiešā veidā caur trankripcijas regulāciju, gan netiešā veidā caur izmaiņām šūnas metabolismā vai attīstības stadijā • Nosakot visu šūnas gēnu ekspresijas līmeni kādā noteiktā etapā, ir iespējams rekonstruēt gēnu ekspresijas tīklu Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  22. Eksperimenta plānošana • Tehniskā kļūda • Bioloģiskā variācija Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  23. GeneChip datu kvalitāte • GeneChip datiem ir zema tehniskā kļūda • Galvenā problēma ir bioloģisko datu variabilitāte, tāpēc plānojot eksperimentus jācenšas novērst vai vismaz novērtēt, cik liela būs bioloģiskā kļūda Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  24. Tehniskās un bioloģiskās kļūdas Close etal. (2004) PlantPhys, 134:960 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  25. Eksperimentu plānošana Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  26. Affymetrix gēnu ekspresijas analīzes sistēmas • Affyčipi • Reaģenti (mērķa RNS iezīmēšana un sagatavošana hibridizācijai ) • Aparatūra (hibridizācija, čipu skanēšana) • Datu analīzes programmatūra • NetAffx analīzes un atbalsta centrs Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  27. Programmas DNS čipu datu analīzei • MAS5 (MicroarraySuite) vai GCOS (GeneChipOperatingSoftware) • GeneSpring • Bioconductor (un R) • R Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  28. Bioconductor Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra http://www.bioconductor.org

  29. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra http://www.r-project.org/

  30. GeneSpring Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra http://www.chem.agilent.com/scripts/pds.asp?lpage=27881

  31. Gēnu ekspresijas datu analīze MAS5 • .dat -> .cel -> .chp • Lielākais, ko var izdarīt ar MAS, ir salīdzināt vienu čipu ar otru, apskatīties katras zondes hibridizācijas intensitāti, uzzināt datus par eksperimentu • Tipiskā eksperimentā izmanto daudzus čipus, tādēļ tālāk jāizmanto citas analīzes programmas, piemēram GeneSpring Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  32. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  33. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  34. Statistiskās metodes čipu datu analīzei • MAS statistiskās metodes • ANOVA diferenciālai gēnu ekspresijas noteikšanai • H0 = gēnu ekspresija nav atšķirīga • I. tipa kļūda – “falsepositive” – statistiskais tests parāda, ka H0 ir nepatiesa (gēnu ekspresija IR atšķirīga), lai gan īstenībā H0 ir patiesa • II. tipa kļūda – “falsenegative” – statistiskais tests parāda, ka H0 ir patiesa (gēnu ekspresija NAV atšķirīga), lai gan īstenībā H0 ir nepatiesa • Galvenokārt cenšas kontrolēt I. tipa kļūdu Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  35. Statistiskās metodes čipu datu analīzei • Standarta statistikas metodes (p-vērtība) ir pārāk striktas gēnu ekspresijas datu analīzei • Multipletestingproblem(http://en.wikipedia.org/wiki/Multiple_comparisons) • Samazinot I. tipa kļūdu tiek palielināta II. tipa kļūda (“falsenegative”) • FDR – FalseDetectionRate – parāda paredzamo “falsepositive” daudzumu datos • FDR slieksni nosaka no novērotā p-vērtību sadalījuma, tādēļ tas mainīsies no datu veida • FDR = 0.01 nozīmē, ka mēs pieļaujam, ka starp 100 diferenciāli ekspresētiem gēniem 1 patiesībā nav diferenciāli ekspresēts Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  36. MIAME • MinimumInformationAbout a Microarray Experiment • Brazmaetal. (2001) Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nat Genet 29:365 • Informācijai par čipu eksperimentu jābūt: - pietiekamai, lai varētu interpretēt rezultātus un atkārtot eksperimentus - strukturētai, lai rezultātus datu bāzēs varētu atrast un analizēt izmantojot atbilstošu metodi Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  37. Gēnu ekpresijas datu bāzes • NCBI GEO • EBI ArrayExpress • Papildus informācija http://plantgenetics.lu.lv/files/MIAME_presentation.ppt • Datu iesniegšana šajās datu bāzēs nodrošina (piespiež) MIAME standarta ievērošanu Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  38. DNS čipi jaunu RNS veidu atklāšanai • Ja zināma pilna genoma sekvence, mēs varam mēģināt paredzēt visus tajā esošos gēnus • Izejot no tā, varam izveidot GeneChip uz kura visi šie gēni būtu reprezentēti, un pārbaudīt vai tie tiešām ir ekspresēti • Tā mēs varam eksperimentāli apstiprināt vai paredzētie gēni tiešām ir ekspresēti, bet neko jaunu mēs tādā veidā atklāt nevaram Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  39. DNS čipi jaunu RNS veidu atklāšanai • Izveido GenomeTilingčipu – oligonukleotīdi nosedz visu genoma sekvenci un abus DNS pavedienus • Hibridizē ar kopējo RNS no visdažādākajiem audu veidiem • Identificē visas zondes, kas uzrāda hibridizāciju un salīdzina to atrašanās vietu genomā ar zināmajām gēnu sekvencēm • Identificē jaunas ekspresētas DNS sekvences • Bertoneetal.(2004) Global identification of humantranscribedsequences with genometilingarrays. Science 306: 2242-2246 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  40. Genotipēšanasčipi • Ja genoma rajons, kas hibridizējas ar zondi, ir atšķirīgs starp dažādiem indivīdiem, tad hibridizācija būs vājāka un to var identificēt kā polimorfismu • Ja “tilingarray” nosedz genomu ar 1 nukleotīda soli, tad ar to palīdzību var identificēt pat punktveida mutācijas • Mockler,T.C. and Ecker,J.R. (2005) Applications of DNA tiling arrays for whole-genome analysis. Genomics 85: 1-15 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  41. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  42. Genotipēšanasčipu darbības shēma Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  43. Komerciālie Affymetrixgenotipēšanasčipi • Cilvēka genoma čips 5.0 • Cilvēka genoma čips 6.0 • Cilvēka genoma kartēšanas 500K čipi • Cilvēka genoma kartēšanas 100K čips • Cilvēka genoma kartēšanas 10K čips Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  44. Kartēšanas 500K čipa shēma Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  45. Cilvēka genoma čips 6.0 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  46. Proteomika • Pētījums par organisma vai šūnas proteīnu kopumu • Proteīni ir šūnas mašīnas, kas veic lielāko daļu šūnas pastāvēšanai nozīmīgo darbību • Proteīnu sastāvs, izvietojums šūnā, mijiedarbības, dinamika, ekspresijas līmenis un lokalizācija • http://plantgenetics.lu.lv/files/The_Inner_Life_Of_A_Cell.avi • http://multimedia.mcb.harvard.edu/anim_innerlife_hi.html Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  47. Proteomikas metodes • 1D un 2D elektroforēze • Masas spektrometrija • Peptīdu masas fingerprintings • MS/MS proteīnu sekvenēšanai Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  48. Masas spektrometrija • Fizikāla analīzes metode, kas ļauj raksturot un identificēt molekulas balstoties uz to jonu masas un lādiņa attiecību • Vienlaicīgi precīza analīzes metode un augstas caurlaidspējas metode • Proteīnu maisījumu komponentu identificēšana • Proteīnu sekvenēšana, SNP genotipēšana • Post-translācijas modifikāciju analīze • http://www.astbury.leeds.ac.uk/facil/MStut/mstutorial.htm Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  49. Proteomikassoļi http://www.biotechniques.com/news/Mistaken-identities-in-proteomics/biotechniques-312015.html Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

  50. Masas spektrometrijas shēma Protein Sample Sample prep Mass Analyzer: Separates ions Data System Detection Device Ion source:makes ions Bioworks Excalibur SEQUEST Mascot In-house TOF Quadropole Ion Trap FT (ICR) MS MALDI ESI http://www.healthsystem.virginia.edu/internet/biomolec/mass_spectrometry.cfm Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

More Related