Mjerenje i upravljanje procesa u proizvodnji biljnih stanica

1. Mjerenje i upravljanje procesa u proizvodnji biljnih stanica Filip Cingesar Ines Ivanuša Valentina Lukinović

2. biljke kao hrana • više od 60% lijekova protiv raka i 75% lijekova za infektivne bolesti • najvažniji parametri : prinos željenog/ih metabolita i/ili volumetrijska produktivnost biljaka u in vitro sustavu

3. Ključni korak - prijenos biosintetskih procesa iz tikvica na tresilicama u bioreaktor • Biosinteza ovisi o načinu uzgoja i fiziološkom stanju biljnog izvora

4. Dizajn bioreaktora pogodnih za uzgoj biljnih stanica

5. Kako bi se postigao što veći prinos biomase, a u konačnici i proizvoda, potrebno je znati odrediti tip bioreaktora za uzgoj biljnih stanica. • Pri odabiru pogodnog bioreaktora najvažnije je uzeti u obzir karakteristike radnih stanica: morfologija, tolerancija sila smicanja, brzina rasta i proizvodnje proizvoda

6. Osnovni tehnološki uvjeti neophodni za uzgoj biljnih stanica u bioreaktoru: • homogenost i miješanje podloge • optimalna aeracija • dugoročno sterilni uvjeti • uvođenje izvora svjetlosti

8. Barbotirajuća kolona Air-lift reaktor Reaktor s mješalom A – ulaz zraka CC – komora za staničnu kulturu G – izlaz plinova M – medij MG – regenerator pare MI – para R - spremnik BioWave reaktor

9. Kontinuirani bioreaktor s mješalom Barbotirajuća kolona (uzgoj algi)

10. Kultura kosmatog korijenja • Prikladni bioreaktori za rast kosmatog korijenja moraju biti prilagođeni fiziološkim, morfološkim i reološkim svojstvima kulture

12. visoka koncentracija stanica narušava homogenost sustava te mogu nastati stagnacijske zone te tako miješanje postaje glavni kriterij pri odabiru bioreaktora za uzgoj biljnih stanica.

13. Trendovi u projektiranju biorekatora za biljne satnice • Rabe se bioreaktori čija je unutrašnjost obložena sterilnom plastikom (smanjuje se trošak sterilizacije) : • wave reaktori • imerzijski reaktor RITA

14. Wave bioreaktor

15. Parametri nadzora i upravljanja • On-line praćenje parametara: temperatura, tlak, brzina miješanja, pjenjenje, pH, stopa aeracije,pO2 i pCO2 iz zraka • Off-line praćenje parametara: prinos biomase, veličina, oblik, masa i proizvodnje sekundarnih metabolita stanice te se provode uz vremensku zadršku

16. Optimizacija biomase • U samim začecima kulture biljnih stanica u biotehnologiji optimizacija biomase provodila se korišenjem različitih koncentracija jednog, najčešće glavnog nutrijenta ili fitohormona • Novije metode uključuju "blokove" u kojima se mjenjaju tri ili četri uvjeta procesa u kombinacijama na 3 razine

17. Jedna od metoda za određivanje važnosti tri neovisne varijable je prošireni simpleks postupak- otopljeni kisik, agitacija, temperatura • Primjena strukturnih nutritivnih modela - opisivanje i predviđanje rasta stanica i njihovih reakcija na nutrijente

18. potpuno drukčiji pristup optimizaciji rasta biomase predlaže testiranje svakog nutrijenta, odnosno grupe nutrijenata (npr. vitamini) zasebno pri čemu se koncentracija proučavanog nutrijenta ne mijenja tokom procesa

19. Miješanje • promiče homogenost s obzirom na masu biljnih stanica i hranjivih tvari • povećava prijenos mase i topline • 3 tipa bioreaktora s obzirom na agitaciju : mehanički miješani, pneumatski miješani ili kombinirani • osjetljivost biljnih stanica na smicanje

20. Aeracija • ispunjava tri glavne funkcije : održavanje aerobnih uvjeta, desorpcija isparljivih proizvoda i uklanjanje metaboličke topline • specifična stopa O2 (respiracija) biljke ovisi o liniji kulture stanica, uvjetima kultivacije i fazi rasta • dCL/ dt = KLaL (C*-CL) • nekoliko metoda za mjerenje KLaL vrijednosti • Idealne vrijednosti - > 0.1-0.5 L / L/min

21. Npr, optimizacija aeracije je kod uzgoja biljnih stanica veoma bitna i potrebna je njena stalna kontrola. Optimalna stopa aeracije određena je pritokom zraka(kisika) i ona se kontinuirano kontrolira on-line nadzorom i regulacijom.

22. Temepratura • van't Hoff-ov zakon • svaki proces biološke konverzije ima svoju optimalnu temperaturu • Utjecaj na temperaturu kultivacije : rast kulture biljnih stanica i sinteza željenih metabolita • fino ugađanje temperature problem u većim mjerilila

23. Optimiranje uvjeta uzgoja • povećanje isplativosti i ekonomska opravdanost • slabo istraživana • optimizacija osnovnih procesnih parametara

24. Downstream processing • kompleksne strukture • pektocelulozno tkivo i membrane kao glavne barijere • Ekstrakcija • Purifikacija

25. Ekstrakcija • fizikalno- kemijska svojstva metabolita i njihova kasnija namjena • Polarnost, pH • Metaboliti - vodenim puferom ili organskim otapalima • Biomasa u suhom stanju - organskim otapalima

26. Purifikacija i izolacija • Preparativna kromatografija • Protustrujna kromatografija

27. Zaključak • mali napredak prema širokim primjenama • ograničeni broj spojeva u velikom mjerilu • ekološki problemi i ograničenje daljnjih berbi • značajni napredak bioreaktorskih konfiguracija

28. Literatura: • Ting-Kuo Huang. Karen A. McDonald - Bioreactor engineering for revombinant protein production in plant cell suspension cultures • Regine Eibl, Dieter  Eibl - Design of bioreactors suitable for plant celland tissue culture • Regine Eibl, Stephan Kaiser, Renate Lombriser, Dieter Eibl – Disposable bioreactors: the current state-of-the-art and recommended applications inbiotechnology • Pamela J. Weathers, Melissa J. Towler, Jianfeng Xu - Bench to batch: advances in plant cell culture for producing useful products • Milen I. Georgijev, Jost Weber, Alexandre Maciuk – Bioprocessing of plant cell cultures for mass production of target compounds