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第十四章 RNA 的生物合成

第十四章 RNA 的生物合成. DNA 转录 RNA 的复制。 RNA DNA RNA. RNA 的生物合成. 转录（ transcription）： 以一段 DNA 的遗传信息为模板，在 RNA 聚合酶作用下，合成出对应的 RNA 的过程( DNA 指导的 RNA 合成） 。 转录产物： mRNA 、rRNA、 tRNA、 小 RNA

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第十四章 RNA 的生物合成

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Presentation Transcript

  1. 第十四章RNA的生物合成 DNA转录 RNA的复制。 RNA DNA RNA RNA的生物合成 转录（transcription）：以一段DNA的遗传信息为模板，在 RNA聚合酶作用下，合成出对应的RNA的过程(DNA 指导的RNA合成）。 转录产物：mRNA 、rRNA、 tRNA、小RNA 除某些病毒基因组RNA外，绝大多数RNA分子都来自DNA转录的产物。

  2. 第一节、DNA转录 一、转录的单位 转录通常具有一定的起点和终点，这段转录的 区域叫做转录单位。 原核生物 多顺反子 一个转录单位 真核生物 单顺反子 （一）、控制转录的起始区域—启动子 1、启动子定义：RNA聚合酶识别、结合并开始转录所必需的一段DNA序列。

  3. 转录单位

  4. 2、启动子序列的测定—足迹法和DNA测序法 足迹法：即是将DNA起始转录的限制片段分离出来。加RNA聚合酶使之结合。再用DNA酶部分水解。与酶结合的部位被保护而不水解，其余部位水解成长短不同的片段，经凝胶电泳即可测出酶所结合的部位

  5. （1）、-10序列（Pribnow框）：解链区 定义：在转录起点上游大约-10处，有一个6bp的保守序列TATAAT，称Pribnow框。此段序列出现在-4到-13bp之间，解链区决定转录方向。 频度： T89 A89 T50 A65 A65 T100 作用：Pribnow框决定转录方向。酶在此部位与DNA结合形成稳定的复合物，Pribnow框中DNA序列在转录方向上解开，形成开放型起始结构，它是RNA聚合酶牢固的结合位点，是启动子的关键部位。 问题：设计一个探针能够最大数量的与E.coli启动子杂交。 （5-ATTATA-3）

  6. -10序列对转录的效率影响 • TATAAT→AATAAT，转录效率下降,称为下降突变（down mutation）。 • TATGTT→TATATT，转录效率上升，为上升突变（up mutation）。 • 以上突变为何会影响转录效率？ (前者可能由于T-A的堆集能要小于A-T的堆积能，后者可能是由于堆集能降低和氢键的减少) 据预测，Pribnow框中，一开始的TA和第6位最保守的T在结合RNA聚合酶时起十分重要的作用。

  7. （2）、 -35序列（Sexfama box）：识别区 定义：在-10序列上游一个保守序列，其中心约在-35位置，称为-35序列，此序列为RNA酶的识别区域。(只含-10序列的DNA不能转录) 碱基出现频率：T85 T83 G81 A61 C69 A52 ，其中TTG十分保守。 功能：它是原核RNA聚合酶全酶依靠σ因子的初始识别位点。-35序列的核苷酸结构，在很大程度上决定了启动子的强度，RNA聚合酶易识别强的启动子。 -35序列提供RNA聚合酶识别信号， -10序列有助于DNA局部双链解开， -35和-10序列的距离是稳定的，此与RNA pol的结构有关

  8. （3）、转录起始位点（I） 第一个碱基在原核中常为A或G，而且位置固定

  9. 4、

  10. 真核生物Ⅱ类基因的启动子和调控区 TATA框 核心元件 启始子（initiator，Inr）:一般由PY2CAPY5构成， 位于-3～+5 ，可能提供RNA pol Ⅱ识别。 CAAT box、 Ⅱ类启动子 上游元件组成 GC box Oct ．增强子（enhomcer） 远端调控区 减弱子（dehancer） 静息子（sisencer） 上游激活序列（upstream activating seguences UASs）

  11. 真核生物Ⅱ类基因的启动子和调控区

  12. 真核生物RNA聚合酶Ⅱ的启动子 （1）、TATA框（Hogness框）：解链区 定义：中心在-25至-30，长度7bp左右。相当于原核的-10序 列。此序列功能使DNA双链解开 碱基频率：T82 A97 A85 A63 （T37 ）A83 A50（T37 ）（全为A- T，少数含有一个G-C对）。 功能：使DNA双链解开，并决定转录的起点位置，失去TATA框，转录将可能在许多位点上开始。 TATA框的改变或缺失，直接影响DNA与酶的结合程度，会使转录起始点偏移，因此，TATA是绝大多数真核基因正确表达所必需的。

  13. 真核生物RNA聚合酶Ⅱ的启动子 （2）、CAAT框： 聚合酶识别结合区 中心在-75处，9bp，共有序列GGT（G）CAATCT 功能：与RNA聚合酶结合。 （3）、GC框： 在CAAT框上游，序列GGGCGG，与某些转录因子结合。 CAAT和GC框均为上游序列，对转录的起始频率有较大影响。 （4）增强子 其特点是： ① 具有远距离效应。② 无方向性。③ 顺式调节。 ④ 无物种和基因的特异性。⑤ 具有组织的特异性。 ⑥ 有相位性。其作用和DNA的构象有关。 ⑦ 有的增强子可以对外部信号产生反应。

  14. 启动子比较 真核生物RNA聚合酶Ⅱ的启动子和原核生物RNA聚合酶启动子

  15. 转录因子 RNA聚合酶在进行转录时，常需要一些辅助因子（蛋白质）参与作用，此类蛋白质统称为转录因子。 人类Ⅱ型启动子的转录因子 因子 分子量 功能 RNAPolⅡ ≥10K 依赖模板合成RNA TFⅡA 12,19,35K 稳定TFⅡD和DNA的结合，激活TBP亚基 TFⅡB 33K 结合模板链（-10～+10），起始PolⅡ结合，和TFⅡE/F 相互作用 TFⅡD (TBP,30K) TBP亚基识别TATA，将聚合酶组入复合体中，TAFs识别 特殊启动子 TFⅡE 34K(β) 结合在PolⅡ的前部，使复合体的保护区延伸到下游 57K(α) TFⅡF 38, 74K 大亚基具解旋酶活性（RAP74）,小亚基和PolⅡ结合， 介导其加入复合体 TFⅡH 具激酶活性，可以磷酸化PolⅡC端的CTD，使PolⅡ逸出，延伸

  16. 真核生物转录起始复合物的组装 启动子TATA盒+ TFⅡD +D-A复合物(TFⅡD+ TFⅡA) + TFⅡB +(RNA聚合酶+ TFⅡF)复合物 +TFⅡE 、TFⅡJ +TFⅡH（解旋酶、蛋白激酶） DNA解旋、RNA聚合酶C-端Ser磷酸化 从起始点向下游移动

  17. 真核生物转录起始复合物的组装 TFⅡD TFⅡB TFⅡA TFⅡF RNA聚合酶 TFⅡE 、 TFⅡJ TFⅡH

  18. 试解释在真核基因-50位点插入一个5bp的DNA序列比插入一个10bp的DNA序列对RNA聚合酶2的转录起始速率降低的程度影响更大 RNA聚合酶2的启动子除了-27位的（TATA框）外还有-50——-100之间的序列，插入一个10bp序列正 好为一个螺距，和原来的转录因子结合的位点还在 侧，插入一个5bp序列（螺旋半圈），和原来的转录 因子结合的位点在相反一侧

  19. 上游控制元件 核心元件 RNA聚合酶I类启动子 该类启动子最为简单。I类启动子控制的基因只能是rRNA基因。人类细胞中rRNA启动子由两部分组成，① 核心元件，位于转录起始部位前后－45至＋20之间，负责转录的起始。② 上游控制元件（upstream control element, UCE），位于上游－180至－107之间，作用是增加核心元件转录起始的效率。这两个启动子元件的序列85%左右相同，其碱基组成的特点是富含G-C配对。

  20. RNA聚合酶I类转录因子 • 和II类因子相比，I类因子要简单得多，只有SL1和上游结合因子（UBF）两种。 • ★ SL1 • SL1由TATA盒结合蛋白（TBP）和三种TAF组成 • （TAFI110，TAFI63和TAFI48）。 • SL1自身并不与rRNA启动子结合，但它能够扩大和增强 • RNA聚合酶I与上游控制元件的结合。 • ③ SL1有种属的特异性。 • ★ UBF：UAF能够激活完整的启动子或核心元件，并在上游控制元件的协助下介导激活。 • UBF和SL1在刺激转录的过程中有协同作用。

  21. RNA聚合酶I I I类启动子 5sRNA tRNA SnRNA

  22. 小节

  23. （二）、 终止子和终止因子 1、终止子定义： 终止子：提供转录终止信号的一段DNA序列。 终止因子：协助RNA聚合酶识别终止子的蛋白质辅助因子。 2、原核生物的终止因子（terminator factors） （1)．ρ蛋白：这是一种六聚体的蛋白质，亚基的分子量为50kD。该蛋白因子能识别终止信号，并能与RNA紧密结合，导致RNA的释放。 （2)． nusA蛋白：为一分子量69kD的酸性蛋白，它能与RNA及RNA聚合酶相结合，在终止部位使两者被释放。

  24. 3、大肠杆菌中的两类终止子 所有原核生物的终止子在终止点之前都有一个回文结构，它转录出来的RNA可以形成一个颈环式的发荚结构。 （1）、不依赖于ρ的终止子（简单终止子） 简单终止子除具有发夹结构外，在终止点前有一寡聚U序列，回文对称区通常有一段富含GC的序列。 寡聚U序列可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板。 （2）、依赖ρ的终止子 依赖ρ的终止子，必需在ρ因子存在时，才发生终止作用。终止点前无寡聚U序列，回文对称区不富含GC。 ρ因子是55KD的蛋白质，可水解三磷酸核苷。

  25. （1）、不依赖于ρ的终止子（简单终止子） 不依赖于ρ因子的终止子(强终止子)的结构特点 (1) 有回文结构存在； (2) 茎的区域富内含G-C； (3)强终止子3′端上有6个U； 产物RNA形成茎-环结构是终止的关键，茎环结构使转录终止的机理： • 使RNA聚合酶变构，转录停顿； • 使转录复合物趋于解离，RNA产物释放 ☆ RNA pol变构；RNA局部双链影响DNA-RNA杂化双链 ☆ 产物出现一连串U， U :dA配对最不稳定，有利于RNA 从模板脱落。

  26. 不依赖于ρ的终止子（简单终止子）

  27. （2）依赖ρ因子（rho factor）的终止： ρ因子是ρ基因编码的蛋白质，是一种酶，它具有ATPase的活性和解链酶的活性，在水解ATP的情况下，它沿着5′→3′方向转录物的3′端前进，直到遇到暂停在终止点位置的RNA聚合酶。随后ρ因子通过解链酶的活性解开转录泡（transcription bubble）上的RNA/DNA形成的杂交 双螺旋，使RNA转录物得到释放， 从而终止转录。 ρ因子

  28. 大肠杆菌中的两类终止子差别

  29. 4、抗终止作用 通读往往发生在强启动子、弱终止子的基因上。 抗终止作用常见于某些噬菌体的时序控制。早期基因于后基因之间以终止子相隔开，通过抗终止作用可以打开后基因的表达。 λ噬菌体前早期（immediate early）基因的产物N蛋白就是一种抗终止因子。它与RNA聚合酶作用使其在左右两个终止子处发生通读，从而表达晚早期（delayed early）基因。晚早期基因的产物Q蛋白也是一种抗终止因子，它能使晚早期基因得以表达。

  30. （三）转录的不对称性

  31. 转录的不对称性

  32. 转录的不对称性

  33. 确定有义链 J.Marmur和Doty Spiegelnan区分有义链。采用枯草杆菌的SP8噬菌体为材料，SP8 DNA 双链有“ 轻”、“ 重”差异明显。

  34. 二、RNA聚合酶 (RNA-pol)

  35. 原核生物的聚合酶 由五个亚基组成

  36. E.coli RNA聚合酶（原核） E.coli和其它原核细胞只有一种RNA聚合酶，合成各种RNA（mRNA、tRNA、rRNA） 1、σ亚基的功能：无σ亚基的酶叫核心酶，核心酶只能使已开始合成的RNA链延长，而不具备起始合成活性，加入σ亚基后，全酶才具有起始合成RNA的能力，因此，σ亚基称为起始因子。核心酶在DNA上滑动，σ亚基能增加酶与DNA启动子的结合常数，增加停留时间，使聚合酶迅速找到启动子并与之结合，σ亚基本身无催化活性。不同的σ因子识别不同的启动子，从而表达不同的基因。不同的原核生物，都具有相同的核心酶，但σ亚基有差别，这决定了原核基因表达的选择性。

  37. 不同σ因子识别不同启动子

  38. E.coli RNA聚合酶（原核） 2、β亚基：是酶和底物结合的部位和催化位点。利福平(rifampicin)和利福霉素(rifamycin)通过结合β亚基，对全酶有强烈的抑制作用，抑制RNA合成的起始，但不抑制其延长。β亚基基因rpoB突变可使细菌对利福平有抗性。 3、β’亚基：其作用是与模板DNA相结合。β’亚基的碱性较强，适于与模板DNA相结合。肝素是一种多价阴离子，能和β‘亚基结合，从而抑制DNA与RNA聚合酶结合，进一步抑制转录作用。 4、α亚基：功能现尚未知。然而，当噬菌体T4感染E.coli时，其α亚基即在精氨酸上被ADP-核糖化。这种修饰作用使该RNA聚合酶全酶对其原先识别的启动子的亲和力减弱。所以有人认为，α亚基的功能可能参与全酶和启动子的牢固结合。

  39. 细菌RNA聚合酶特点 1. 聚合速率慢，30-85NTP/秒 2. 缺乏外切酶活性,无校对功能，错误率10-6 3. 不同的σ因子识别不同的启动子 4. 可被药物抑制（利福平） 人的RNA聚合酶对利福平不敏感。利用此特点可研制杀菌药物

  40. 大肠杆菌RNA聚合酶与DNA的相互作用

  41. 纯的RNA聚合酶，在离体条件下可转录双链DNA，但在体内，DNA的两条链中只有一条可用于转录，这可能是由于RNA聚合酶在分离时丢失了σ亚基引起的或者DNA提取过程中因断裂失去了控制序列。纯的RNA聚合酶，在离体条件下可转录双链DNA，但在体内，DNA的两条链中只有一条可用于转录，这可能是由于RNA聚合酶在分离时丢失了σ亚基引起的或者DNA提取过程中因断裂失去了控制序列。 解旋和重新螺旋化也是RNA聚合酶的内在特性，在酶的前端解螺旋，在后端以相反方向重新螺旋化，活体状况中，可能还有其它酶活性来帮助调整DNA的拓扑学性质。 37℃时，RNA聚合酶的聚合速度可达50个核苷酸/秒 与蛋白质翻译速率15个氨基酸/秒相仿 但是慢于DNA复制的速率800bp /秒

  42. 原核生物RNA pol执行多功能 (1) 识别DNA双链上的启动子； (2) 使DNA变性在启动子处解旋成单链； (3) 通过阅读启动子序列，RNA pol确定它 自己的转录方向和模板链。 (4) 最后当它达到终止子时，通过识别停止转录。

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