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PCR Quantitative. F Martin-Laurent et D Bru UMR Microbiologie et Géochimie des Sols, INRA/Université de Bourgogne, 17 Rue Sully, BP 86510, 21065 DIJON CEDEX, Email fmartin@dijon.inra.fr et david.bru@dijon.inra.fr. FML 13-12-04. Démonstration de PCR quantitative.

albert
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  1. PCR Quantitative F Martin-Laurent et D Bru UMR Microbiologie et Géochimie des Sols, INRA/Université de Bourgogne, 17 Rue Sully, BP 86510, 21065 DIJON CEDEX, Email fmartin@dijon.inra.fr et david.bru@dijon.inra.fr FML 13-12-04

  2. Démonstration de PCR quantitative • Principe de la PCR quantitative (F Martin-Laurent) • Exemple d’applications de la PCR quantitative (F Martin-Laurent) • Démonstration de l’utilisation du logiciel SDS (F Martin-Laurent) • Démonstration de l’utilisation de l’ABI7900 (D Bru

  3. Amorces, ADN, dNTPs, Taq Pol Dénaturation du double brin d’ADN et hybridation des amorces 95°C 72°C Elongation 72°C 55°C x 35 cycles Séparation électrophorétique Principe de la PCR conventionnelle FML 13-12-04

  4. Analyse en point final sur gel d’agarose • Analyse dynamique de la PCR quantitative • haute précision pendant la phase exponentielle • variabilité importante à la phase plateau Phase exponentielle Phase linéaire Phase plateau PCR conventionnelle versus PCR quantitative FML 13-12-04

  5. FAM, VIC TAMRA Quencher Reporter FP 3’ 5’ 3’ 5’ RP PCR quantitative avec une sonde TaqMan® Cette méthode repose sur deux principes : -la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer) -l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol -Spécificité l’amorce pour la PCR -Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan FML 13-12-04

  6. Fluorescence FP Q R 3’ 5’ 3’ 5’ RP Essais 5’ nucléase avec la sonde TaqMan® -FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie), pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte FML 13-12-04

  7. FP Q 3’ 5’ -au cours de l’élongation catalysée par la Taq Pol l’activité 5’ nucléase déplace la sonde R 3’ 5’ RP R Q FP 3’ 5’ 3’ 5’ RP -lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule d’ADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence. Essais 5’ nucléase avec la sonde TaqMan® FML 13-12-04

  8. Excitation -Le spectre d’emission du Reporteur recouvre le spectre d’absorption du Quencher FAM Absorbtion Fluorescence nm 475 550 FRET Absorbtion TAMRA Fluorescence Émission nm 550 600 Mécanisme de quenching -FRET FML 13-12-04

  9. R NFQ MGB TaqMan® MGB probes • NFQ non fluorescent quencher • Nouvelle innovation MGB minor groove binder stabilise les 5 à 6 dernières bases de la sonde (à son extrémité 3’) sonde plus courte et plus spécifique (pour un Tm donné) FML 13-12-04

  10. Mesure de fluorescence en fin d’élongation PCR quantitative SYBR ®Green FML 13-12-04

  11. TaqMan ® SYBR ® Green TaqMan ® versus SYBR ® Green Spécificité -fixation des amorces, -hybridation de la sonde, -conditions PCR -fixation des amorces, - -conditions PCR Flexibilité -multiplexe, -détection de SNP, - - - -utilisation d’amorces dégénérées Optimisation -standardisée -dépend du gène ciblé -vérifier la formation de dimère d’amorces FML 13-12-04

  12. Echantillon 1 Echantillon 2 FAM Rn FAM ROX Fluorescence Fluorescence Rn ROX Rn= Reporter / Passive référence ROX™ comme référence passive Le marqueur fluorescent ROX ™ permet de normalisé les variations de fluorescence non reliées à la PCR (fluorescence des plaques ou tubes, contamination du bloc PCR,…) FML 13-12-04

  13. 4 3 Rn 2 Ct 1 Bruit de fond 2O 3O 4O 5O 10 La valeur de Ct est déterminée dans la phase exponentielle, à l’intersection de la ligne de bruit de fond avec la courbe de fluorescence cycle Ligne de base Détermination du Ct (cycle seuil) FML 13-12-04

  14. Courbe de calibration : comparer les valeurs de Ct Nombre de copies (log) Fluorescence émise (UA) Ct Log N = -0,26 Ct + 10,85 R2= 0,998 106 105 104 103 102 101 Cycle seuil - Ct Nombre de cycles Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est fonction du nombre d’ADN cibles initialement présents FML 13-12-04

  15. Quantification absolue Log N = -0,26 Ct + 10,85 R2= 0,998 Nombre de copies (log) Fluorescence émise (UA) Ct 106 105 104 103 102 101 Cycle seuil - Ct Nombre de cycles Résultat : l’échantillon d’ADN (ex: 25 ng) contient 10000 copies du gène cible FML 13-12-04

  16. Efficacité de la PCR quantitative Log N = -0,26Ct + 10,85 R2= 0,998 Nombre de copies (log) Efficacité = 10(-pente) -1 atzA Cycle seuil - Ct Si la pente est égale à 0.301 alors l’efficacité de la PCR quantitative est de 100 % Exemple pente = -0.26 E = 10(0.26) –1 = 1.82 – 1 = 0.82 soit 82 % FML 13-12-04

  17. PCR efficace à 100% y = x (1 + E)n Quand E = 1 alors : Ct = + 1  augmentation x2 Ct= + 3.32  augmentation x10 cas spécifique E = 1 alors y = x 2n y=nombre de copie du gène cible x=nombre de copie initiale E=efficacité n=nombre de cycle PCR FML 13-12-04

  18. Quantification relative • pas besoin de courbe de standard • calcul des résultats pas comparaisons des Ct • nécessité de définir : • un gène cible servant de contrôle endogène, • un gène cible servant de standard. • le contrôle endogène : - donne une image de la quantité de matrice apportée (ADN ou ADNc), - est présent en quantité constante dans tous les échantillons, - normalise : - les biais d’extraction et de contaminations par des inhibiteurs (ADN) - les variations d’éfficacité de transcription inverse FML 13-12-04

  19. Standard t=2 t=4 t=7 t=14 t=21 t=0 -t0 ajout d’atrazine à des mésocosmes de sol, -t0 sera utilisé comme valeur standard FML 13-12-04

  20. Rn Contrôle endogène Contrôle endogène Rn Gène cible Gène cible Ct = 22 – 16 = 6 Ct = 21 – 15 = 6 Ct=16 Ct=22 Cycle Ct=16 Ct=22 Cycle Ct=15 Ct=21 Comparaison du gène cible avec le contrôle endogène Si 2 x plus de matrice ? FML 13-12-04

  21. t2 t0 Rn Rn Ct=16 Ct=16 Ct=26 Cycle Ct=32 Cycle t4 t7 Rn Rn Ct=12 Ct=15 Ct=22 Cycle Ct=31 Cycle Contrôle endogène Gène cible Comparaison de Ct FML 13-12-04

  22. Comparaison de Ct Etape 1: normalisation par rapport au contrôle endogène Ct gène cible – Ct contrôle endogène = Ct Etape 2: normalisation par rapport au standard Ct échantillon - Ct standard = Ct Etape 3: détermination de la variation du nombre de copie du gène cible 2-Ct FML 13-12-04

  23. Quantification relative des résultats t0 t2 64 64 t4 Augmentation par x t7 1 1 standard FML 13-12-04

  24. Exercice (1/4) Contrôle 16S rRNA Ct 14 atzA Ct 32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzA Ct29 Quel échantillon d’ADN est le plus concentré et de combien de fois ? 16S rRNA étant utilisé comme contrôle endogène…. FML 13-12-04

  25. Exercice (2/4) Contrôle 16S rRNA Ct 14 atzA Ct 32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzA Ct29 Ct 16SrRNA = 16 –14 = 2 2Ct 16SrRNA = 22 = 4 La concentration d’ADN de l’échantillon contrôle est 4 x plus élevée que celle de l’échantillon atrazine. FML 13-12-04

  26. Exercice (3/4) Contrôle 16S rRNA Ct 14 atzA Ct 32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzA Ct29 Quel échantillon d’ADN contient le plus grand nombre de copie de la séquence atzA ? FML 13-12-04

  27. Exercice (4/4) Contrôle 16S rRNA Ct 14 atzA Ct 32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzA Ct29 Ct contrôle= 32 – 14 = 18 Ct atrazine= 29 – 16 = 13 Ct = 18 – 13 = 5 2Ct = 25 = 32 Le nombre de copie du gène atzA est 32 fois plus élevé dans l’échantillon de sol traité avec l’atrazine que dans le contrôle FML 13-12-04

  28. Analyse de la structure des communautés microbiennes Amplification PCR Amorces universelles : 38f et 72r IGS 5’ A 16 S 23 S 3’ RISA : Ribosomal Intergenic Spacer Analysis IGS 5’ B 16 S 23 S 3’ MM MM MM MM 12 14 15 16 17 18 20 21 22 25 26 44 45 46 47 48 49 50 kpb • Profils de bandes complexes • numérisation du gel et analyse statistique (présence/absence, intensité des bandes) 1.114 0.900 0.404 0.242 0.190 0.147 0.124 FML 13-12-04

  29. FM SS100 U SS10 L IA 900 692 501 484 404 320 LP FP HP LDCSS- HAP U LDSS LDCSS Analyse des communautés microbiennes du sol de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule. Couhins Pierrelaye La Bouzule U : contrôle LDSS : boue deshydratée LDCSS : boue deshydratée compostée LDCSS+HAP : boue deshydratée compostée amendée avec des HAP U : contrôle FM : fumier 10t/h/an SS10 : boue 10t/h/an SS100 : boue 100t/h/an LP : pollution faible FP : pollution moyenne HP : pollution élevée FML 13-12-04

  30. 0.25 0.16 0.16 -0.25 0.15 -0.16 0.35 -0.16 0.16 PC2 20% -0.2 -0.15 PC2 21% -0.15 SS10 LDSS LP FM PC1 45.3% U SS100 PC1 30% HP LDCSS PC1 30% LDCSS-HAP U PC2 15.2% FP La Bouzule Couhins Pierrelaye Analyse des communautés microbiennes du sol de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule. U : contrôle LDSS : boue deshydratée LDCSS : boue deshydratée compostée LDCSS+HAP : boue deshydratée compostée amendée avec des HAP U : contrôle FM : fumier 10t/h/an SS10 : boue 10t/h/an SS100 : boue 100t/h/an LP : pollution faible FP : pollution moyenne HP : pollution élevée FML 13-12-04

  31. Cinétique de minéralisation de l ’atrazine des sols de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule. Couhins Pierrelaye La Bouzule FML 13-12-04

  32. a a b a b b b b b Potentiel génétique de minéralisation de l ’atrazine des sols de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule. a a ab a ab a ab ab a a b b b b b ab b ab a a a a a a FML 13-12-04

  33. PRINCIPE DE LA RT-qPCR 1 ARNm = 1 ADNc 1. Transcription inverse d’ARNm cibles en ADNc 2. Quantification des ADNc par PCR quantitative en temps réel - qPCR Nombre de copies (log) Fluorescence émise (UA) Ct Log N = -0,26 Ct + 10,85 R2= 0,998 106 105 104 103 102 101 Cycle seuil - Ct Nombre de cycles Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est fonction du nombre d’ADN cibles initialement présents FML 13-12-04

  34. OH Cl N N N N atzC NHCH2CH3 OH (CH3)2CH2HN HO N N Acide cyanurique atrazine atzA OH N N (CH3)2CH2HN NHCH2CH3 N Hydroxyatrazine atzB OH N N OH (CH3)2CH2HN N N-isopropylammélide VOIE DE MINÉRALISATION DE L’ATRAZINE atzD H2N NH2 O O N H Biuret atzE - H2N O O O N H Allophanate atzF CO2 + NH4+ FML 13-12-04

  35. Niveau d’expression de l’ADNr 16S ARNr 16S / ng d’ARN extrait Temps (min) Temps (min) la quantité d’ARNr 16S est stable pendant l’expérience L’ARNr 16S = référence interne pour la mesure de l’expression des gènes atz au cours du temps FML 13-12-04

  36. Niveau d’expression des gènes atzA, B et C P.ADP C. heintzii atzA atzA • P.ADP • - ATRAZINE : • Expression basale des gènes atz • + ATRAZINE : • Augmentation transitoire de l’expression des gènes atz ARNm /106ARNr 16S ARNm /106ARNr 16S Temps (min) Temps (min) atzB atzB • C. heintzii • - ATRAZINE : • seul atzA s’exprime • + ATRAZINE : • Augmentation de l’expression des gènes atzA et B • Pas d’expression d’atzC ARNm /106ARNr 16S ARNm /106ARNr 16S Temps (min) Temps (min) atzC atzC ARNm /106ARNr 16S ARNm /106ARNr 16S Temps (min) Temps (min) L’EXPRESSION DES GÈNES ATZ EST FONCTION DE LA SOUCHE BACTÉRIENNE CONSIDÉRÉE FML 13-12-04

  37. Niveau d’expression des gènes atzD, E et F atzD 2 000 a 1 500 a x 150 ab 1 000 a Relative number of mRNA a 500 ab a b b b b b 0 0 100 200 300 400 Time (min) atzE 160 a 140 120 100 80 60 Relative number of mRNA x 20 a a a 40 b ab 20 b ab b b 0 0 100 200 300 400 Time (min) atzF 400 350 300 Temps (min) 250 200 150 Relative number of mRNA 100 50 0 0 100 200 300 400 Time (min) En absence d’atrazine, atzD, E et F s’expriment de façon basale L’expression d’atzD et atzE augmentent300 min après l’ajout d’atrazine L’expression d’atzF n’est pas affectée par l’ajout d’atrazine Augmentation de l’expression des gènes de l’opéron atzDEF selon un gradient FML 13-12-04

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