ESTUDIO DE SENSIBILIDAD A LOS AGENTES ANTIMICROBIANOS

1. ESTUDIO DE SENSIBILIDAD A LOS AGENTES ANTIMICROBIANOS Raúl Gil Orts MIR 2 Análisis Clínicos

2. INTRODUCCIÓN El estudio de la sensibilidad a los agentes antimicrobianos : - se lleva a cabo mediante antibiogramas - su objetivo es evaluar la susceptibilidad in vitro - el resultado servirá como factor predictivo de la eficacia clínica del agente antimicrobiano Una vez conocida la sensibilidad del microorganismo: - se reduce la morbi-mortalidad - se reduce la duración de la estancia hospitalaria - contribuye a una mejor evolución del paciente - reduce los costes sanitarios Es una herramienta básica para evitar el mal uso de los antimicrobianos

3. INTRODUCCIÓN El estudio de sensibilidad pueden realizarse por distintos métodos que requieren: - Aislamiento absoluto de la cepa que se va a testar - Identificación adecuada de la cepa para: - tipo de antibiograma - interpretación de los resultados - Medios y consumibles adecuados Métodos: - Difusión - Antibiograma disco-placa - Método de tiras Epsilon (Etest) - Dilución - Dilución en agar - Dilución en caldo - Macrodilución - Microdilución

4. Métodos de difusión • Fundamento: • Difusión del antibiótico desde un soporte sólido hacia una base de agar Agar M-H Antibiótico • La base de agar es generalmente Mueller-Hinton recomendado por CLSI por: • Buena reproducibilidad • Baja concentración de inhibidores que permite el crecimiento de la mayor parte de las bacterias patógenas • Se le añaden los suplementos necesarios para asegurar el crecimiento de organismos exigentes

5. Métodos de difusión • Antibiograma disco-placa • - Es uno de los recomendados por el CLSI para la determinación de la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos • Ampliamente utilizado en la práctica habitual de los laboratorios • Fundamento: • -Se deposita en la superficie de agar de una placa de petri previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel secante impregnados con los diferentes antibióticos. • -El antibiótico difunde radialmente a través del espesor del agar a partir del disco formándose un gradiente de concentración. • - Transcurridas 18-24 horas de incubación, se estudia el crecimiento en ellas. Se valora el diámetro de la zona de inhibición que se forma alrededor de cada disco y se compara con las referencias informando si el microorganismo es Sensible, Intermedio o Resistente.

6. Métodos de difusión • Antibiograma disco-placa • Interpretación: • Está basada en la correlación existente entre el diámetro de los halos de inhibición y la respuesta in vivo. • Esta correlación está estudiada para los antibióticos más comunes y los principales agentes bacterianos y puede ser consultada en diferentes institutos y sociedades ( MENSURA, EUCAST, CLSI) • Inconveniente: ofrece resultados cualitativos ( S, I, R ) • No da información sobre CMI

7. Procedimiento Antibiograma difusión Disco-placa Inoculación Placa agarMueller-Hinton Dispensador de discos ATB

8. Métodos de difusión Método de tiras Epsilon (Etest) Comparte el fundamento con el anterior pero aquí se puede conocer la CMI Es un método alternativo para el estudio cuantitativo de la sensibilidad antimicrobiana, sencillo y se correlaciona bien con el método de dilución en caldo Consiste en una tira de plástico no poroso que incorpora un gradiente predefinido de antimicrobiano . Se inocula la placa de agar con el microorganismo, se coloca la tira de E-test sobre su superficie produciéndose la difusión del antibiótico desde el soporte hasta el agar. Tras la incubación se puede observar una zona de inhibición elipsoidal y simétrica. La CMI será el valor obtenido en el punto de intersección de la elipse de inhibición con la tira.

9. Tiras Epsilon (E-test) Lectura de resultados: Después del período de incubación se lee la CMI en el punto de intersección entre el extremo de inhibición de la elipse y la tira de E-test. -Consideraciones: Cuando la CMI coincide entre dos marcas se informa el valor superior Si se observan intersecciones diferentes, se informa el valor más alto, siempre que la diferencia entre los dos valores no sea superior a la mitad de un paso de dilución doble. Si se observan colonias grandes en la zona de inhibición puede representar cultivo mixto o variantes resistentes. Debemos repetir el test a partir del cultivo primario. Si se repite el mismo patrón tendremos que trabajar las colonias que aparecen en la zona de inhibición.

10. Métodos de dilución • Fundamento: • Estos métodos se basan en la determinación del crecimiento del microorganismo en presencia de concentraciones crecientes del antimicrobiano que se encuentra diluido en el medio de cultivo (caldo o agar). • Después de la incubación adecuada se observa la turbidez de los tubos, que indica desarrollo bacteriano. El microorganismo crecerá en los tubos que no contengan suficiente agente antimicrobiano como para inhibir su desarrollo. • La concentración de antibiótico que presente ausencia de crecimiento se designa como la Concentración Mínima Inhibitoria. • -Indicaciones: • Se consideran de referencia para determinar de forma cuantitativa la actividad de los antimicrobianos. ( uso en centros de referencia) • En estudios de correlación para evaluar otros métodos • Estandarizan el estudio de susceptibilidad y son la base de estudios epidemiológicos y poblacionales • Ventajas: aportan resultados de CMI y CMB (concentración mínima bactericida) • Inconvenientes: Son más complejos técnicamente y más caros que los de difusión • Exigen una absoluta estandarización debido a la gran cantidad de variables de los que depende su realización • Alto grado de laboriosidad (no posible en laboratorios alta carga)

11. Dilución en agar Es un método bien establecido para la determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos. Se preparan varias placas de medio de cultivo sólido en base agarMueller-Hinton cada una con una determinada concentración de antimicrobiano y se hace crecer el microorganismo. Tiene buena reproducibilidad de los resultados de sensibilidad Permite buen crecimiento de la mayoría de patógenos.

12. Dilución en agar • Interpretación: • La CMI será la concentración de antibiótico contenida en el agar de la primera placa sin colonias bacterianas. • Si el microorganismo crece en todas las placas, la CMI es superior a la mayor concentración de antimicrobiano estudiada. • Si no crece en ninguna de las placas, la CMI es inferior a la menor concentración de antimicrobiana estudiada.

13. Dilución en caldo • El crecimiento se realiza en un medio líquido, en el que se ha realizado una dilución conocida del antimicrobiano. • En función del volumen de medio utilizado tenemos dos tipos: • Macrodilución: el volumen es superior o igual a 1 mL • Microdilución: se suelen emplear volúmenes de 0,1 mL • Macrodilución: • Bien estandarizado • Debido a la laboriosidad del procedimiento y la disponibilidad de otros sistemas de dilución no suele emplearse de rutina.

14. Macrodilución Incubación a temperatura y atmósfera óptima 18-24 h Inoculación 0,5mL de inóculo Interpretación Interpretación del estudio: La CMI será la concentración de antibiótico contenida en el tubo de ensayo del primer tubo sin presencia de turbidez. Si el microorganismo crece en todos los tubos, la CMI es superior a la mayor concentración de antimicrobiano estudiada. Si no crece en ningún tubo, la CMI es inferior a la menor concentración de antimicrobiano estudiada.

15. Dilución en caldo Microdilución en caldo: Es el método de referencia dentro de los métodos de dilución para estudiar la sensibilidad a antimicrobianos y sirve como base para la realización de métodos automáticos y semiautomáticos. Está basado en la inhibición del crecimiento microbiano en un medio líquido en presencia de una concentración de antibiótico en progresión aritmética. • Interpretación: • La CMI será la concentración de antibiótico contenida en el primer pocillo donde no se observa crecimiento bacteriano (no turbidez) • Si el microorganismo crece en todos los pocillos, la CMI es superior a la mayor concentración de antimicrobiano estudiada. Si no crece en ningún pocillo, la CMI es inferior a la menor concentración de antimicrobiano estudiada.

16. Dilución en caldo Sistema automatizado de microdilución en caldo: Se automatiza del proceso de inoculación a la lectura del resultado del método de microdilución. Ideales para grandes volúmenes de trabajo. Ventajas: manejo sencillo, menor consumo de recursos humanos, alta reproducibilidad, análisis de resultados mediante sistemas expertos y su rapidez. Inconvenientes: elevado coste en consumibles, sólo garantía para investigar microorganismos de crecimiento rápido y sin requerimientos especiales. Interpretación: 1. Se emplea un análisis de regresión para determinar la CMI derivada del crecimiento observado.

17. Interpretación de los métodos de estudio de sensibilidad a los agentes antimicrobianos En los métodos descritos se obtiene un valor numérico, en forma de mm o de CMI o CMB. Representan concentraciones que se deberían alcanzar en el lugar de infección Esta traslación no se puede realizar o es muy compleja, con lo que se categoriza dichos valores numéricos en forma de interpretaciones cualitativas que informen de la susceptibilidad de cada uno de los antimicrobianos frente a un determinado germen. Las categorías interpretativas son: - Sensible (S): el microorganismo está inhibido a la concentración de antimicrobiano que suele alcanzarse cuando se prescribe la dosis recomendada para el lugar de la infección. Hay una alta probabilidad de que el paciente responda al tratamiento. - Intermedio (I): la tasa de respuesta puede ser más baja que para los microorganismos sensibles. Implica eficacia clínica en las localizaciones corporales donde los antimicrobianos están fisiológicamente concentrados o cuando una dosis superior a la habitual puede ser empleada.

18. - Resistente (R): el crecimiento del microorganismo no está inhibido por la concentración de antimicrobiano alcanzable con la dosis habitual. El agente no es eficaz en el tratamiento contra el microorganismo.

19. CONTROL DE CALIDAD Necesidad de control: Debido al gran número de factores que pueden afectar el resultado Para armonizar y estandarizar los procedimientos realizados y los resultados obtenidos Controles de calidad a varios niveles: - Controles de contaminación: aseguran que el microbiano obtenido pertenece al germen en estudio y no a un contaminante. Se incuba un medio de cultivo de los utilizados sin inocular – debe ser estéril - Controles de crecimiento: controlan que los medios de cultivo utilizados soportan adecuadamente el crecimiento de los gérmenes a evaluar. Se lleva a cabo mediante inoculación del microorganismo en medio de cultivo que se incubará a igual temperatura y duración que el resto del ensayo. El control presentará crecimiento homogéneo y abundante. - Controles de resultado: aseguran que los resultados obtenidos no son diferentes a los reales. Se usan cepas de referencia con CMI, CMB o diámetros conocidos. Los resultados de dichas cepas deben estar dentro del rango de resultado permitido.

20. GRACIAS Gracias