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基因工程 Gene Engineering

高等学校生物工程、生物科学及生物技术专业教材. 基因工程 Gene Engineering. 彭银祥等编 著. 第 2 章 基因工程的分子生物学基础 Basic Molecular Biology of Gene Engineering. 华中科技大学出版社 2008 年 2 月第二次印刷. 2.1 核酸的结构与功能. 2.1.1 遗传物质与 DNA 和 RNA. 1 ） DNA 是主要遗传物质 作为遗传物质的 DNA 主要特性： 1 ）储存遗传信息； 2 ）将遗传信息传递给子代； 3 ）物理和化学性质稳定； 4 ）具有遗传变异特性。

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基因工程 Gene Engineering

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  1. 高等学校生物工程、生物科学及生物技术专业教材高等学校生物工程、生物科学及生物技术专业教材 基因工程Gene Engineering 彭银祥等编著 第2章 基因工程的分子生物学基础 Basic Molecular Biology of Gene Engineering 华中科技大学出版社2008年2月第二次印刷

  2. 2.1 核酸的结构与功能

  3. 2.1.1 遗传物质与DNA和RNA 1）DNA是主要遗传物质 作为遗传物质的DNA主要特性： 1）储存遗传信息； 2）将遗传信息传递给子代； 3）物理和化学性质稳定； 4）具有遗传变异特性。 2）RNA也是遗传物质 在某些病毒中，它的核酸只有RNA，如逆转录病 毒，类病毒。

  4. 1.染色质与DNA （Chromosome and DNA） 2.1.2 DNA的结构与功能

  5. 染色质(Chromatin):指间期细胞核内由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA组成的线性复合结构, 是间期细胞遗传物质存在的形式。 ◆染色体(chromosome):指细胞在有丝分裂或减数分裂过程中, 由染色质聚缩而成的棒状结构。 ◆染色体与染色质比较●没有差异，●构型不同，●是在细胞周期不同阶段的不同表现形式。

  6. H2A H2B H3 H4各2分子～200bp DNA H1 • 核酸酶处理核小体产生含146bp核心颗粒。 • 146bp围绕核心颗粒形成1.8圈，每圈约80bp

  7. Ø10-11 nm

  8. 30nm 纤维

  9. 染色质的高级结构DNA containing genes is tightly packed into chromosomes

  10. Bases Glycosidic (glycoside, glycosylic) bond (糖苷键) phosphate Ribose or 2’-deoxyribose Adenosine 5’-triphosphate，ATP 2 DNA的结构与功能 核酸的化学组成 Phosphate ester bond

  11. （1）碱基(Bases) Bicyclic 嘌呤碱 Purines: Monocyclic 嘧啶碱 pyrimidine: Thymine (T) is a 5-methyluracil (U)

  12. Glycosidic (glycoside, glycosylic) bond (糖苷键) Ribose or 2’-deoxyribose R （2）核苷 (Nucleoside)

  13. (3) 核苷酸 （Nucleotide)

  14. DNA的以及结构与功能（核酸的共价结构） 核酸的共价结构主要指的是一级结构 一级结构：分子内核苷酸的排列顺序。 DNA的主要功能： 1 遗传信息的储存：分子内核苷酸的排列顺序储存遗传信息。 2 DNA复制、转录的模板：DNA→DNA、DNA→RNA

  15. DNA的一级结构 3’-5’ Phosphodiester bridge or 3’-5’ phosphodiester bond

  16. 主要功能：DNA信息分子中核苷酸的排列顺序储存着特定的遗传信息。主要功能：DNA信息分子中核苷酸的排列顺序储存着特定的遗传信息。 1、一类信息是负责编码细胞内组成型蛋白质氨基酸序列的信息。 2、另一类是负责编码一大类重要的调控蛋白以及决定基因表达的开启或关闭的序列元件，即负责基因表达的调节控制。这部分DNA在细胞的不同周期、个体的发育不同阶段、不同组织器官及不同的环境使基因选择性表达。

  17. DNA的二级结构与功能 DNA的共价结构主要指双螺旋结构。 • 双螺旋结构的主要功能： 1、确立了DNA存在的形式， 2、对维持遗传物质的稳定性具有重要意义；

  18. DNA的二级结构与功能 DNA的二级结构：是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所形成的双螺旋结构。 基本特点： （1）主链：是由两条反向平行的脱氧核苷酸链盘绕所形成的；DNA分子中的脱氧核糖与磷酸交替连接并排列在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧； （2）碱基对：两条链上的碱基之间通过氢键结合形成碱基对，它们之间的规律是嘌呤与嘌呤配对；嘧啶与嘧啶配对。 （3）大沟是双螺旋与双螺旋之间形成的沟，小沟是双螺旋的互补链之间形成的沟。 （4）结构参数：螺旋直径2nm,每圈含10bp,螺距3.4nm，相邻碱基对的平面距离0.34nm。

  19. Watson & Crick 模型1 右手双螺旋： 2 碱基配对：A T,G C 3 螺旋参数：碱基堆积距离0.34nm, 夹角36,旋转一周3.4nm，含有10nt, 平均直径2nm。 4 大沟和小沟：大沟宽2.2nm 小沟宽1.2nm。 5维持稳定性： （1）氢键 G C （2）碱基堆积力 （3）正负电荷的作用 （4）其它作用因素

  20. DNA二级结构的其他形式 • DNA的几种构型：通常情况下DNA的二级结构分为两大类： • 右手螺旋：A-DNA and B-DNA • 左手螺旋：Z-DNA • DNA的水溶液通常为B-DNA，另外 A-T丰富的DNA片段常呈现B-DNA； • DNA的双链中一条被相应RNA链所替换，就会形成A-DNA。如，在杂交分子或DNA处于转录状态时； • B型 DNA中的多聚G-C区易形成左手螺旋DNA,即Z型DNA

  21. DNA的几种构型 双螺旋 碱基倾角 碱基距离 螺旋直径 每轮碱基数 螺旋方向 B-DNA 1 0.34 2.37 10.4 右手 A-DNA 19 0.23 2.55 11 右手 Z-DNA 9 0.38 1.84 12 左手

  22. (3) DNA的三级结构与意义 DNA的三级结构：是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构，成为超螺旋结构（superhelix or super coil)。

  23. 三级结构的意义 • 盘绕、压缩后对维持DNA的稳定性有意义。 • 影响DNA的解链过程，从而影响与其他大分子如酶，蛋白质等的结合。

  24. 2.1.3 RNA的二级结构与功能 • 核酸组成：A、G、U、C • RNA单链线型分子，自身形成二级或三级结构。除tRNA外，几乎都与蛋白质结合。 • 功能：信息分子，功能分子。 • 重要功能：① 参与蛋白质合成； ② 具有生物催化剂的功能； ③ RNA转录后的剪接与加工； ④ 参与基因的表达调控； ⑤ 与生物体的进化有关；

  25. O- BASE 5’ -O-P-O-CH2 ß O O 1’ O- H H BASE 5’ O- H BASE 5’ 2’ -O-P-O-CH2 3’ -O-P-O-CH2 OH ß O O ß O 1’ O 1’ H H H H H H 2’ 3’ 2’ OH OH 3’ OH Phosphodiester bonds in RNA 3’-5’ Phosphodiester bridge or 3’-5’ phosphodiester bond 5’ 3’

  26. 细胞内RNA的分布 • 成熟的RNA主要分布在细胞质中。 • 主要分为三大类：转运RNA（tRNA）；信使RNA（mRNA）；核蛋白体RNA（rRNA）。 • 细胞核内的RNA（nRNA），另一部分是核内小RNA（snRNA）核不均一RNA（hnRNA），转移－信使RNA（tmRNA）siRNA，micRNA。

  27. UGAUAAUAG AUG AAUAAA (A)nAAOH3’poly A m7G5’ppp5’Nm(Nm) 5’帽子 5’非编码区 编码区 3’非编码区 RNA的分类概述 1、mRNA的结构 • mRNA存在于细胞质，总量不到细胞总RNA的5％； • 真核细胞mRNA是单顺反子(monocistron)； • 原核细胞是多顺反子(poly-cistron)；

  28. ● 原核生物 mRNA 5’端 300nt±前导序列(A/G-------------AUG) Shine-Dalgarno 序列 (S.D) GGAGG S.D 序列---------------------AUG 9Nt 最佳 富含A,U, → G突变，翻译能力 poly-cistron

  29. ● 真核生物 单顺反子 前导序列 5’ m7Gppp--- -----CCACC-----A-3---A1U2G3G4— 核糖体小亚基扫描AUG的信号序列 至关准确翻译

  30. 2 tRNA的结构 ● tRNA含量较多，约占总细胞总RNA的15％； ● tRNA由74－95个核苷酸组成，通常为76个； ● tRNA phe, 77Nt构成的三叶草型 (1964 Holly R.) ● Nt 多被甲基化修饰,（含有稀有碱基组成的核苷，如：假尿嘧啶核苷（），二氢尿苷（D），肌苷（I）等） ● 5 arms & 4 loops

  31. tRNA的二级结构特征 • 1、含有稀有碱基和稀有核苷酸，达核苷酸总量的5－20％； • 2、3’端含有一个CCA序列，是所有tRNA接受氨基酰化的位置，它是tRNA合成后加上的； • 3、所有的tRNA分子形成三叶草的二级结构和L型构象； • 4、tRNA分子有5个臂和4个环；

  32. I type ; 3-5 Nt 3/4 tRNA II type ; 13-21 Nt ---aa accept arm ; loading aa at 3’ end ---TΨC loop; contact with 5s rRNA ---DHU loop; contact with AARS ---anti-codon loop; 34th is wobble base ---extra loop; classification marker ?

  33. 3. rRNA的结构 • rRNA是所有RNA中含量最多的一类，占细胞总RNA的80％以上；与蛋白质结合存在。 • 核糖体由RNA和蛋白组成，真核细胞中1：1，原核细胞中2：1。 • rRNA 中修饰碱基比tRNA少，甲基化约占2％。不同生物来源的rRNA（类16s，23s）一级结构的某些区域具有高度的序列同源性。 • rRNA分子内有大量的茎环结构，使其具有多种构象，二级结构十分复杂。 • rRNA的结构在蛋白质合成中，随着mRNA和tRNA的结合及亚基蛋白分子的组装将发生改变，rRNA的二级结构始终处于动态的变化中。

  34. ● 在原核生物23s, 16s, 5s / 在真核生物28s-5.8s, 18s, 5s ● 富含甲基化 (m2U, m3A, m3U, m26A(二甲基)…)

  35. 21proteins 31proteins (a) E. coil 30S subunits Two-dimensional gel electrophoresis of proteins（蛋白二维电泳） (b) E. coil 50S subunits. Kaltschmidt & Wittmann PNAS 67 (1970) f. 1-2, pp. 1277-78.)

  36. ● 5s RNA 与TΨC loop of tRNA部分同源，并可配对 ● In Prok. 5s RNA121nt与23s rRNA 组成大亚基 ● In Prok. 16s RNA1542nt与大亚基组成核糖体 16s rRNA的3’端富含CCUCCU保守序列，它与mRNA的5’端的前导序列富含GGAGG的SD互补

  37. 3’-end of 18s rRNA 与原核生物高度相似, 但无与 S.D.seq.互补的保守序列 Bacterial 16S Mammalian 18srRNA ●在真核生物 在 mRNA的AUG上游存在CCACC核糖体扫描序列成为核糖体识别第一个 AUG的信号 Shine-Dalgarno seq. (S.D seq) GGAGG AMEAMECCUGCGGUUGGAUGACCUCCUU AMEAMECCUGCGGAAGGAUGAUUA 高度相似

  38. ● 在真核生物 大亚基由28s rRNA4718nt , 5.8s rRNA158nt 5s rRNA120nt 与45种蛋白构成； 小亚基由18s rRNA1874nt rRNA与30种蛋白构成。 特点：修饰碱基比tRNA少； 二级结构复杂； 5sRNA一级结构序列比其它rRNA保守性高; rRNA的构象处于不断的动态变化中；

  39. ● More hairpin structue

  40. 4. snRNA • 真核细胞核内特有snRNA, 存在于细胞核内或核质及核仁中，在基因转录加工过程中具有重要作用； • snRNA含有70－300nt，不是任何RNA前体； • snRNA有20多种其中13中富含U，占分子内的35％。U1，U2，U3在真核细胞转录中对hnRNA的加工是必需的； • snRNA通常是与蛋白质结合形成核蛋白体（snRNP）复合物发挥作用；

  41. 5. snoRNA ( small nucleolar RNA） • 核仁小分子RNA广泛分布于酵母和真核细胞的核仁区； • 哺乳动物细胞的snoRNA以U命名，酵母的以snR命名 • 根据结构比较，将其分为两类：①boxC/D型：5’端含有boxC(UGAUGA)序列，3’端有boxD (CUGA),在boxD上游有8－14nt与rRNA内的保守核心序列互补；②boxH/ACA型：其3’端第三个核苷酸上游有一个保守的ACA或类似序列AGA，AUA。整个分子形成两个发卡结构中间是保守的boxH(ANANNA)的铰链区。

  42. 功能： 1.作为rRNA前体加工复合体的重要组分，参与rRNA前体的加工。 2.参与rRNA2’-O-核糖的甲基化修饰。 3.参与部分snRNA tRNA的甲基化修饰。 4.boxH/ACA型能指导rRNA中的嘧啶向假尿嘧啶的转换。

  43. 6. 非编码RNA • 近年来发现的一类非编码RNA。 • 不具有ORF。 • 功能：主要参与胚胎发育、肿瘤形成和抑制、细胞生长和分化、染色体失活等。

  44. 2.1.4 核酸的理化性质及其应用 1 核酸的一般理化性质 核酸具有较强的酸性； 核酸是线性大分子，粘度较大； 在机械力的作用下，易断裂； 核酸的光吸收在A260处最大，可用该性质进行核酸定量分析及测定A260/ A280的比值确定核酸的纯度。

  45. 2 DNA分子变性( DNA denaturation ) ● D.S. DNA S.S. DNA ( 加温, 极端pH, 尿素, 酰胺 )

  46. 引起DNA变性的主要因素： ①加温； ②极端的pH值； pH=12, 碱基的酮式 烯醇式 pH=2-3, 碱基上的氨基发生质子化 主要影响氢键的形成。 ③有机溶剂、尿素、酰胺等； 它们与DNA分子的碱基形成氢键。使DNA保持单链状态。

  47. D.S DNA S.S DNA 粘度降低 ？ 高分子溶液 〉普通溶液 线状分子 〉不规则线团 〉球形分子 D.S. DNA 钢性较强，结构较为舒展的 双螺旋； S.S. DNA 没有氢键的支撑； 由螺旋结构向折叠和线团结构转变 变性过程表现在以下变化 ①S.S. DNA-溶液的粘度降低 ②S.S.DNA沉降速度加快

  48. ③S.S.DNA分子的A 260 nm UV 值上升( Hyperchromicity ) 当SSDNA相互靠近在一起时两条链内的碱基淬 灭了一些光吸收。两条链分开时淬灭消失。

  49. dNTPs A260 = 1.60 S.S DNA A260 = 1.37 D.S DNA A260 = 1 Concentration 50μg/ml Opetical Density 1.24 Tm( 解链温度) :在一定温度范围内，紫外光吸收值增加达到最大增加值的50%的温度叫做DNA的解链温度（Tm）。 = OD增加值的中点温度(一般为85-95℃)

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