Auguères Anne-Sophie Boulotte Nadine UE 106 : Diversité des Organismes Marins Master 1 BEM

1. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms Boyer et al., 2009 Auguères Anne-Sophie Boulotte Nadine UE 106 : Diversité des Organismes Marins Master 1 BEM

2. Introduction Matériels et méthodes Résultats et discussions Conclusion Connaissances actuelles et quelques définitions Virus = entité biologique qui se sert des métabolites de son hôte pour se multiplier Virion = particule virale NCLDV = Nucleocytoplasmic Large DNA Virus. 6 familles avant la découverte du Marseillevirus : Phycodnavirus, Poxvirus, Asfarvirus, Mimivirus, Iridovirus et Ascovirus. Question redevenue actuelle suite à la découverte des virus géants : un virus doit-il être considéré comme vivant ou non ?

3. Introduction Matériels et méthodes Résultats et discussions Conclusion Marseillevirus : virus géant à ADN qui infecte les amibes Forme icosaédrique (20 triangles équilatéraux) La capside mesure 250nm de diamètre Génome de 368kb (5ème plus grand génome viral connu) correspondant à 457 gènes Amibes : organismes eucaryotes unicellulaires (Amoebobiontes), vivent en milieu aquatique.

4. Introduction Matériels et méthodes Résultats et discussions Conclusion • Isolement de Marseillevirus : • Pièces de métal introduites dans une tour de refroidissement à Paris • Prélèvement d’une pièce et d’un échantillon d’eau chaque semaine (x52) • Filtration du biofilm formé et de l’échantillon d’eau à l’aide d’un filtre de 0.22µm • Filtrats mélangés dans une solution saline PAS et inoculés dans une culture d’Acanthamoebapolyphaga(Amoebobionte) • Caractérisation structurale de Marseillevirus : • Utilisation de la microscopie électronique et de l’immunofluorescence après congélation des virions de Marseillevirus dans de l’éthane liquide • Séquençage et analyse du génome de Marseillevirus : • Pyroséquençage • Comparaison des séquences des protéines à l’aide de la base de données BLASTP • Analyses phylogénétiques : maximum de vraisemblance et méthode de neighbor-joining

5. Introduction Matériels et méthodes Résultats et discussions Conclusion Développement d'une usine à virions dans le cytoplasme vers le noyau de l'amibe Virions de Marseillevirus après phagocytose par une amibe Noyau 2μm 2μm Temps t0 + 30min t0 + 6h infection t0

6. Introduction Matériels et méthodes Résultats et discussions Conclusion Poxvirus 100 Asfarvirus Phycodnavirus • Marseillevirus : • Représente une nouvelle famille de virus • Regroupement fortement soutenu avec le taxon Iridovirus-Ascovirus • 28 gènes sur 41 en communs avec le gène ancestral des NCLDV (Iyeret al., 2006) 100 93,68 Mimivirus 98,58 Marseillevirus 100 Iridovirus 99,95 Iridovirus 64 Ascovirus 0,5 Arbre basé sur la méthode de Maximum de vraisemblance Comparaison de 5 protéines universelles de la famille des grands virus nucléocytoplasmiques (Iyeret al., 2001)

7. Introduction Matériels et méthodes Résultats et discussions Conclusion Asfarvirus Poxvirus • Marseillevirus : • Regroupé avec le taxon Mimivirus-Mamavirus • Caractéristique notable : 17 gènes partagés avec le taxon Mimivirus-Mamavirus mais absents des autres NCLDV Marseillevirus Mimivirus Mamavirus Phycodnavirus Iridovirus Iridovirus Ascovirus 0,5 Arbre basé sur la méthode de Neighbor-joining par comparaison d’un répertoire de gènes (Wolf et al., 2002)

8. Introduction Matériels et méthodes Résultats et discussions Conclusion Poxvirus Asfarvirus Représentation graphique arbre ou réseau? Pas de renseignement sur le groupe externe Arbres non congruents et non compatibles Iridovirus - Ascovirus Phycodnavirus Mimivirus Marseillevirus Iridovirus Consensus strict en ne gardant que les nœuds soutenus par les deux méthodes

9. Introduction Matériels et méthodes Résultats et discussions Conclusion Pourcentage du génome total Grands virus nucléo plasmiques 11,2% (51) Bactéries et phages 10,7% (49) Autres eucaryotes 7,4% (34) Amoebo-biontes 5,5% (25) Origine incertaine 6,3% (29) Origines probables des gènes à partir de l'analyse des séquences Étude de 188 protéines de Marseillevirus qui présentent des homologies avec d'autres dans différentes banques de données (BLASTP). Hypothèse : transferts horizontaux de gènes (HGTs) à partir d’au moins quatre sources.

10. Introduction Matériels et méthodes Résultats et discussions Conclusion Autre virus Amibe HGT Usine à Marseillevirus Bactérie phagocytée HGT HGT Noyau Schéma d’une amibe et des interactions entre les différents organismes Organismes chimériques : virus issus de recombinaisons entre plusieurs génomes

11. Introduction Matériels et méthodes Résultats et discussions Conclusion • Amibe : permet un mélange de gènes par HGTs entre l'hôte eucaryote et ses divers virus, bactéries, parasites et symbiontes. Ce mélange semble produire des génomes chimériques tels que celui du Marseillevirus. • Place du Marseillevirus au sein des NCLDV pas encore totalement définie • Découverte du Marseillevirus très récente, mais il se pourrait qu’il soit retrouvé dans d’autres écosystèmes, infectant d’autres hôtes, comme c’est le cas pour d’autres NCLDV (Claverie et al., 2009).

12. Références bibliographiques Boyer M., Yutin N., Pagnier I., Barrassi L., Fournous G., Espinosa L., Robert C., Azza S., Sun S., Rossman M.G., Suzan-Monti M., La Scola B., Koonin E.V., Raoult D., 2009. Giant Marseillevirus highlights the rôle of amoebae as a melting pat in emergence of chimeric organisms. Proceedings of the National Academy of Sciences 106(51) : 21848-21853. Claverie J.M., Grzela R., Lartigue A., Bernadac A., Nietsche S., Vacelet J., Ogata H., Abergel C., 2009. Mimivirus and Mimiviridae : Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges. Journal of Invertebrate Pathology 101 : 172-180. Iyer L.M., Aravind L., Koonin E.V., 2001. Common origin of four diverse families of large eukaryotic DNA viruses. Journal of Virology 75(23) : 11720-11734. Iyer L.M., Balagi S., Koonin E.V., Aravind L., 2006. Evolutionary genomics of nucleo-cytoplasmic large DNA viruses. Virus Research 117 : 156-184.

13. Annexes

14. Tableau comparatif du Marseillevirus avec un rétrovirus (VIH)

15. Pyroséquençage • Rapide • Peu coûteuse • Lecture directe de la séquence obtenue Polymérase ACCTTGAGTACCATCTAGGA------------------- AGATCCT------------------- ACTT dATP PPi ATP sulfurylase Apyrase Intensité du signal lumineux ATP dXMP Pyrogramme Luciférase Signal lumineux capté par le séquenceur Lumière dNTP incorporés

16. Immunofluorescence indirecte • Rapide • Détection de protéines virales (antigènes) directement dans un échantillon grâce à des anticorps couplés à la fluorescéine + + + + + Fixation des anticorps primaires Virions congelés de Marseillevirus Détection des anticorps secondaires