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这是关于 DNA 重组技术的较好课件

这是关于 DNA 重组技术的较好课件. 重组 DNA 技术. 11.1 重组 DNA 技术是基因工程的核心技术 11.2 获得需要的目的基因（外源基因） 11.3 构建重组质粒和基因克隆 11.4 转化受体细胞和转化子的筛选 11.5 转化子的分析 —— Southern 杂交. 11.1 重组 DNA 技术是基因工程的核心技术. 重组 DNA 技术， 又称为 基因克隆 或 分子克隆技术 ， 克隆 (clone)--- 无性繁殖 分子克隆 – DNA 的无性繁殖技术 重组 DNA 技术 包括了一系列的分子生物学操作步骤。

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这是关于 DNA 重组技术的较好课件

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Presentation Transcript

  1. 这是关于DNA重组技术的较好课件

  2. 重组DNA技术 11.1 重组DNA技术是基因工程的核心技术 11.2 获得需要的目的基因（外源基因） 11.3 构建重组质粒和基因克隆 11.4 转化受体细胞和转化子的筛选 11.5 转化子的分析——Southern杂交

  3. 11.1 重组DNA技术是基因工程的核心技术 重组DNA技术，又称为基因克隆或分子克隆技术， 克隆(clone)---无性繁殖 分子克隆– DNA的无性繁殖技术 重组DNA技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。 重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。

  4. 基因工程(genetic engineering) • 所谓基因工程(genetic engineering)就是把外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制，转录，翻译表达的操作叫基因工程。 • 基因工程可使另一种生物获得新的遗传性状或表达所需要的产物。

  5. 重组DNA操作一般步骤： （1）获得目的基因； （2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子； （3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传； （4）对转化子筛选和鉴定； （5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。

  6. 11.2 获得需要的目的基因（外源基因） 获得需要的目的基因常用的方法： （1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库(genomic DNA library)，从中调用目的基因； （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库； （3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。 （4）化学合成

  7. 细胞内总DNA的提取分离与基因组文库的构建 • 细胞内总DNA的提取分离程序 苯酚沉淀蛋白质

  8. 紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。

  9. 基因组DNA文库的构建 将总DNA经过酶解，经蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶电泳分离不同长短的DNA片段。包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库。

  10. cDNA文库的构建 mRNA 反转录 cDNA (互补DNA） 第二条DNA链

  11. 反转录人工合成互补DNA, cDNA 构建基因文库获取目的基因存在的问题—— 费时费事 内含子序列 反转录人工合成互补DNA方法的优势—— 获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因

  12. 加入4种物质： （1）作为模板的DNA序列；（2）与被分离的目的基因两条链 各自5’端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）。 • 聚合酶链式反应（PCR） • PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。

  13. 聚合酶链式反应（PCR） • 变性、退火、延伸三步曲 变性：双链DNA解链成为单链DNA 退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链

  14. 聚合酶链式反应（PCR） • 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍 30轮循环可获得—— 230（1.07×109)个基因片段

  15. PCR(多聚酶链式反应)

  16. PCR技术的发明 PCR的发明是DNA操作技术的革命 美国Mullis教授 开汽车时的联想 逶迤崎岖的山路——DNA双螺旋 行驶的汽车——一小段DNA引物 …… 1988年发明了PCR技术 1993年获得诺贝尔奖

  17. 11.3 构建重组质粒DNA和基因克隆 基因重组和克隆操作最重要的工具是： 1.限制性内切酶 2.载体 和 3.宿主菌 微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝后，才能实现进一步的重组、转化和表达等操作。 • 限制性内切酶 限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。

  18. 分子刀-DNA限制性内切酶

  19. 识别特定的核苷酸序列 4~6个碱基对 形成粘性末端或平端

  20. 重组DNA的操作

  21. 限制性内切酶 已经发现和鉴定了200多种 EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段 粘性末端 T4连接酶

  22. 基因体外重组 The formation of a recombinant DNA molecule

  23. 载体 载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具， （1）能够自我复制，并带动插入的外源基因一起复制 （2）具有合适的限制性酶切位点 （3）具有合适的筛选标记 （4）细胞内拷贝数要多 （5）载体的分子量要小 （6）细胞内稳定性高 目前最常用的载体包括细菌质粒、l噬菌体、cosmid质粒等。

  24. 质粒 质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。

  25. 质粒载体的一般结构

  26. DNA克隆常用载体

  27. 11.4 转化受体细胞和转化子的筛选 基因克隆获得大量目的基因后，就要使其在合适的宿主细胞中表达，产生需要的基因表达产物或使宿主生物具备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳定遗传。这一过程就是遗传转化。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对转化的大肠杆菌进行培养使目的基因大量表达和积累。对表达产物分离纯化便可获得想要的产品。 通过DNA体外重组技术构建的重组质粒还可以直接用以转化蓝藻等原核生物或其他一些原生生物。

  28. 宿主菌或受体细胞 • 大肠杆菌 • 酵母 • 昆虫细胞 • 哺乳动物细胞 • 感受态细胞（competent cell）

  29. 受体细胞和重组基因的导入（转化或转染） 将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤： 1．获得目的基因和质粒载体； 2．形成重组质粒； 3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞； 4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝； 5．筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。

  30. 利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒 pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有IPTG（乳糖操纵子的诱导物）和X-gal，X-gal（ 半乳糖苷酶的底物）便会被半乳糖苷酶水解成兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆。 在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆

  31. 筛选克隆

  32. pUC18载体还携带了抗生素（antibiotic）基因，可筛选重组质粒。

  33. 一般克隆基因的检查和鉴定方法 • 酶切和电泳方法 琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段： 磷酸基团带负电荷 酶解片段向阳极移动 电场驱动力和凝胶阻力 ——不同迁移率 分子量标准参照物

  34. 克隆基因的检查和鉴定方法 酶切 Restriction mapping

  35. DNA杂交直接鉴定 32P标记的DNA分子探针 杂交 放射自显影法

  36. 植物遗传转化常用的方法 载体法转化——农杆菌介导法（Ti质粒） 基因的直接转移 （1）高压电脉冲电激穿孔 （2）基因枪法 （3）微注射法

  37. 构建缺失chlL基因的蓝细菌突变株（直接转化重组质粒）构建缺失chlL基因的蓝细菌突变株（直接转化重组质粒）

  38. 11.5 转化子的分析——Southern杂交 纪念发明者Edward Southern （1）提取总DNA （2）酶解 （3）电泳 （4）转移到滤膜 （5）变性解链 （6）DNA探针及杂交 （7）洗脱 （8）放射自显影 （9）比较分析

  39. 鉴定克隆---Southern分子杂交

  40. Southern杂交分析示例 A. DNA体外重组实验 B. 抗生素筛选转化子细胞 C. 培养突变株细胞 D. Southern杂交实验结果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中 1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学教授Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA体外重组，一举打开了基因工程学大门。

  41. The Human Genome Project

  42. 9.7 人类基因组计划 1988年，美国国家卫生院和能源部 迄今为止在生命科学领域最宏大的研究计划—人类基因组计划 主要内容是完成人体23对染色体的全部基因的遗传作图和物理作图，完成23对染色体上30亿个碱基的序列测定 以美国为主、包括英国、法国、日本和中国多国科学家参加的国际合作计划

  43. 基因组 • 细胞内染色体的总和，基因组亦称染色体组

  44. 国际合作计划 • 美国，英国，法国，德国，日本共同参加人基因组的大规模测序 • 中国1999年7月正式承担人基因组的1%的测序工作。

  45. 研究目标 拟在15年内至少投入30亿美元，完成对人基因组30亿个碱基对的顺序分析，完成对人基因组中全部碱基定位，并开展模式生物基因组研究。

  46. 基因组大小 生物 1013kb 大肠杆菌 4.67 酵母菌 12.1 线虫 97 果蝇 160 小鼠 3000 人 3000

  47. 绘制4张图 • 经典遗传图 • 物理图 • DNA序列图 • 基因转录图

  48. 基因交换导致基因重组 重组率 • 染色体上各基因间的重组率与基因位点间的距离成正比 • 三点测交法 遗传学图

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