Design de Primers..

1. Design de Primers..

2. Serve como um ponto de partida para a replicação de DNA. A DNA polimerase não é capaz de iniciar a síntese de uma nova cadeia de DNA a partir de zero, podendo apenas adicionar a uma cadeia de nucleotídeos existentes.

5. Primers determinam o sucesso de uma PCR! Specificity? Proper annealing to the template?

6. Comprimento do Primer • Determina especificidade e afeta seu • anelamento com o DNA molde! • Muito curto -> baixa especificidade, resultando em amplificação não específica • Muito longo -> diminui a eficiência de ligação ao DNA molde em temperatura normal de anelamento devido à maior probabilidade de formação de estruturas secundárias, como grampos. • Comprimento ideal: • 18-24 bp para PCR comum • 30-35 bp para PCR multiplex

7. Tamanho do amplicon • 150-1000 bp para PCR comum, evitar >3 kb • 50-150 bp para qPCR, evitar >400 bp • Evitar amplicons muito curtos para poder distingui-los de possíveis dímeros de primers!

8. Temperatura de melting (Tm) • A temperatura na qual 50% da dupla fita de DNA se dissocia para fita simples. • Determinado pelo comprimento, composição de base e concentração dos primerse pela concentração de sal no PCR mix • Cálculo aproximado: Tm = 2(A+T) + 4(G+C) °C (indicado para <18mer) • Utilizado para cálcular a temperatura de anelamento (Ta): • Ta Opt = 0.3 x(Tm of primer) + 0.7 x(Tm of PCR product) – 25 • Regra geral: Ta = Tm-5°C

9. Temperatura de anelamento(Ta) • Ta ótima • 52°C - 60°C • Ta baixo aumenta a eficiência da PCR mas diminui a especificidade • Taalto aumenta a especificidade mas diminui eficiência da PCR. • Ta>65°C pode ser recomendado para a amplificação de alvos com elevado conteúdo de GC. • Diferenças de Ta entre o par de primers • Incompatibilidade significativa do par de primers pode levar à má amplificação • Desejável diferença Ta <5°C

10. Para determinar a Ta ótima sempre testar os primers pela 1ª vez em pelo menos 3 diferentes temperaturas (ex. a Ta indicada pelo fabricante ou calculada +/- 2°C)e correr gel! Escolher a máxima temperatura em que há apenas 1 banda (e do tamanho esperado!) e a amplificação ainda é satisfatoria!

11. Especificidade e homologiacruzada • Especificidade • Determinada principalmente pelo comprimento do primer assim como sua sequência • A adequação da especificidade do primer é relativo à natureza do DNA molde utilizado na reação de PCR. • Homologia Cruzada • Pode ser um problema quando o molde de PCR é o DNA genômico ou consiste de fragmentos de genes mistos. • Os iniciadores contendo a sequência altamente repetitiva são propensos a gerar produtos de amplificação não específicos, quando a amplificação de DNA genômico.

12. Para evitar amplificação não específica.. • Além da temperatura e comprimento ideal dos primers: • BLAST dos iniciadores contra banco de dados NCBI de sequência não-redundante é uma maneira comum de evitar projetar primers que podem amplificar regiões homólogas inespecíficas. • Para PCR: Iniciadores que flanqueiam a junção intron-exon, para evitar a amplificação não-específica devido à contaminação por cDNA. • Para qPCR: Iniciadores que flanqueiam a junção exon-exon para evitar amplificação inespecífica devido à contaminação por gDNA.

13. Conteúdo CG e repetições • Conteúdo G/C do Primer • Conteúdo ideal de G/C: 45-55% • Conteúdo semelhante para o par de primers • Recomendado C ou G na extremidade 3’ (aumentar eficiência ligação) • Runs (streches de base única, exaaaaaaa) • Repetições longas aumenta o potencial de anelamento inespecífico • O número máximo aceitável de repetições é de 4 bp • Repetições (streches de di-nucleotídeos • consecutiva, ex. acacacac) • Repetições aumenta o potencial de • anelamento incorreto/inespecífico • O número máximo de repetições aceitável • é de 4 di-nucleotídeos

14. Complementaridade - Estruturas 2árias dos primers • Atrapalham a ligação primer-molde, levando a pouca ou nenhuma amplificação • Análise de ΔG aceitável (energia livre necessária para quebrar a estrutura) • Grampos • Formados por interações intra-moleculares no mesmo primer • Auto-dímero (homodímero) • Formado por interações inter-moleculares entre dois iniciadores iguais • Cross-dímero (heterodímero) • Formado por interações inter-moleculares entre os primers sense e antisense

15. Softwares.. Primer3 (gratuito)

16. Primer BLAST (NCBI) – importante principalmente para fazer scan genômico e avaliar possíveis anelamentos inespespecíficos