酶活性浓度测定的 主要影响因素及控制

1. 酶活性浓度测定的主要影响因素及控制 广州医学院医学检验系 临床生化教研室

2. 酶（enzyme） • 酶的应用 • 临床诊断酶学产生至今已有100年的历史。 • 用于诊断的酶类已超过100多种，常用的数十种。 • 酶测定约占目前临床化学总工作量的1/4到1/2。 • 酶的概念 • 是一种由活细胞产生，具有高度专一性、高度催化活性的特殊蛋白质，又称为生物催化剂。 • 酶的测定方法分为绝对定量法和相对定量法两大类，以后者为主。 • 酶催化化学反应的能力称为酶活性（activity）。 • 酶活性浓度的测定受许多因素的影响。

3. 酶活性浓度测定的主要影响因素 • 1. 标本及标本采集和处理因素 • 2. 试剂及方法学因素 • 3. 仪器因素的影响 • 4. 测定条件与参数设置

4. 1.标本及标本采集和处理因素的影响及控制

5. 1.标本及采集和处理的影响因素 • 1.1 溶血 • 1.2 抗凝剂 • 1.3 温度 • 1.4 空气与光线 • 1.5 标本副反应 • 1.6 酶蛋白浓度 • 1.7 其他

6. 1.1 溶血 • 最重要的影响是RBC内酶的大量释出。 • 大部分酶在细胞内外浓度差异明显，且其活性远高于血清； • 如RBC内的LD、AST和ALT活性分别较血清中高100、15和7倍左右。 • RBC释放的Hb在300～500nm可见光波段能使吸光度值明显升高，干扰分光光度计的测定。

7. 1.1 Hb的吸光度曲线

8. 1.1 溶血影响的控制 • 减少溶血 • 体外溶血可通过实施样品制备技术的标准化加以克服； • 分清体内溶血与体外溶血。 • 减少溶血的干扰 • 可通过设置样品对照，或使用双波长比色、连续监测法以及改进商品试剂等措施，克服对分光光度分析的影响。 • 应用血清(溶血)指数直接判断溶血程度。

9. 1.1 注意: RBC中酶的干扰 • 不仅表现在溶血影响上，采血后如不及时将血清和血凝块分离，血细胞中酶同样可以透过细胞膜进入血清， • 所以，静脉采血后，必须在1～2h内及时离心，将血清与血细胞、血凝块分离，以免引起误差。

10. 1.2 抗凝剂 • 临床上除非测定与凝血或纤溶有关的酶，一般都应以血清作为首选测定标本。 • 大多数抗凝剂都在一定程度上影响酶活性， • EDTA、草酸盐和柠檬酸盐等抗凝剂，它们为金属离子螯合剂； • 在去除Ca2+同时也去除其中Mg2+、Mn2+等离子，Ca2+是AMY的激活剂，Mg2+是ALP、CK和5′-核苷酸酶（5′-NA）的激活剂。

11. 1.2 肝素 • 是一种粘多糖， • 是对酶活性影响最小的抗凝剂， • 对ALT、AST、CK、LD和ACP无影响， • 适于急诊时迅速分离血浆进行测定。

12. 1.3 温度 • 由于血清清蛋白对酶蛋白有稳定作用，如无细菌污染，某些酶（如AST、-GT和ALP等）可在室温保存1～3天活性不受影响。 • 有些酶极不稳定，如血清前列腺ACP，在37℃放置1h，活性可下降50%。

13. *酶不耐融化；§与同工酶类型有关；※标本未酸化；#标本加枸橼酸或醋酸至pH 5 1.3 贮存不同室温体液酶的稳定性（活性变化小于10%）

14. 1.3 温度影响的控制 • 及时检测 • 低温贮存 • 大部分酶在低温中比较稳定，因此当天不能测定时，应在血清分离后置冰箱中冷藏。

15. 1.4 空气与光线 • 血清置于空气中时， • 血中CO2丧失极快，pH可在15min内由7.4增至8.0，从而使对碱性环境敏感的ACP活性迅速下降。 • 某些酶易受光线破坏， • CK可因吸收蓝光而引起酶发生不可逆地失活，其失活程度与暴光时间的长短成正比。

16. 1.5 副反应 • 副反应是指酶促反应体系中，除待测酶反应外，其他非待测酶和物质引起的干扰待测酶测定的反应。 • NAD（P）H是目前使用最多的指示反应物质。 • 体内存在数以百计的氧化还原酶，它们的辅酶很多是一致的。 • 若存在内源性代谢物，必然会相互干扰。

17. 1.5 副反应(酶偶联法测ALT) • 由于反应体系中含有大量NADH和LD，可与血液标本中所含丙酮酸反应，引起340nm波长处吸光度下降，从而引起ALT活性测定误差。 • ALT活性测定的反应式如下：

18. 1.5 副反应的控制 • 可通过加入副反应抑制剂， • 或对样品进行预处理等方法给予排除。 • 双试剂底物启动模式因不增加成本、不耗费时间是最经济的方法。

19. 1.6 酶蛋白浓度 • 酶蛋白在低浓度时易失活，可能是亚基易解离、易吸附于容器上和易发生表面变性之故。 • 酶蛋白在高浓度时较稳定，但活性过高超过检测仪器的线性范围时，需将样品进行稀释或减少样品用量后再行测定。 • 样品稀释后所测得的活性常偏高，可能与抑制剂被稀释有关。

20. 1.7 其他 • 样本器皿的质地和洁净度，采血部位，以及血清中过量的胆红素、脂质，样品制备过程中的振摇等，均可引起酶活性改变。 • 季节 • 冬季气温低，血液凝固慢，血清分离时间延长，可引起血细胞内酶释至血清，加上血清与空气长时间接触，可使某些抑制剂遭到破坏，故冬季测定LD的活性较夏季高。

21. 2. 试剂及方法学因素的影响及控制

22. 2. 试剂及方法学的影响因素 • 酶的测定大多使用商品试剂盒 • 不同厂家酶试剂盒的测定原理、试剂配方（包括缓冲液、底物、添加剂等）、产品质量、技术含量等常有区别。 • 常见的影响因素 • 2.1定时法与连续监测法 • 2.2 检测底物或检测产物 • 2.3 底物启动模式与样品启动模式 • 2.4 正向反应与逆向反应 • 2.5 试剂的干扰作用

23. 2. 影响因素的控制 • 选购试剂盒时 • 要仔细阅读试剂盒说明书； • 了解试剂盒所用方法的原理、试剂配方等； • 选择IFCC或中华医学会检验学会推荐的常规方法，或选择公认的测定方法。 • 使用时 • 定期对试剂盒的质量进行监测； • 准确性、重复性、稳定性好，线性范围宽； • 正向型试剂空白吸光度低、反向型试剂空白吸光度高、试剂空白速率低、瓶间差小等。

24. 酶活性与速度的关系 *酶促反应进程曲线 2. 酶活性测定的原理

25. 2.1 定时法与连续监测法的选用 • 在条件许可的情况下，应尽可能全部采用连续监测法，少用或不用定时法。 • 连续监测法可以选择线性期的反应速度来计算酶活性，测定结果可靠，是首选的方法。 • 但该方法仪器要求相对较高。 • 在基层单位，某些酶采用定时法测定也可以得到比较准确的结果。 • ALP酶活性的测定，如加做样品空白，两法的结果准确性相当。

26. 2.1 连续监测法与定时法的酶促反应时间进程曲线

27. 2.2 检测底物或检测产物的选择 • 取决于哪个更方便，测定的结果更准确。 • 通常原则是选择测定产物的生成量而不是底物的消耗量。 • 反应时底物浓度高，反应时间短； • 这也是淀粉酶的碘淀粉比色法逐渐被色素源底物所取代的原因之一。 • 除部分测定NADH减少可以看成测底物的消耗量外，已很少采用测定底物消耗量的项目。

28. 2.2 检测底物或检测产物的选择 • 底物与产物 • 举例 • ALT测定（赖氏法-定时法） L-丙氨酸 + α-酮戊二酸 α-丙酮酸+ L-谷氨酸 α-丙酮酸 + 2，4-二硝基苯肼 2，4-二硝基苯腙 • (红棕色，λ=505nm) • ALT测定（连续监测法） L-丙氨酸 + α-酮戊二酸 α-丙酮酸+ L-谷氨酸

29. 2.3 底物启动模式与样品启动模式 • 底物启动模式（IFCC推荐采用）。 • 指样品先与缺乏某种底物的试剂1预孵育一定时间后，再加入内这种底物的试剂2，开始启动样品中的待测酶的酶促反应。 • 好处是在待测酶酶促反应开始之前，可以除去某些干扰物，包括内源性干扰物和外源性干扰物。 • 这种模式需要双试剂剂型。 • 样品启动模式。 • 指反应所需的试剂先混合在一起，然后加入样品，依靠样品中的待测酶来启动酶促反应； • 只是在延滞期去除部分干扰物。 • 这种模式可采用单一试剂剂型。

30. 双试剂与单试剂酶促反应时间进程曲线 2.3 底物启动模式与样品启动模式

31. 2.3 需要注意 • 某些双试剂剂型是基于试剂稳定性考虑，并没有将底物单独作为第二试剂，也起不到消除内源性干扰的作用。

32. 2.4 正向反应与逆向反应 • 一般根据测定底物或产物的难易程度来决定。 • 除原则上选择对底物亲和力大，酶转换率高的方向外，还应考虑内源性干扰、底物价格和稳定性等诸多因素。 • 例如， • CK的测定普遍采用逆向反应，因其逆向反应是正向反应的6倍，而且受影响因素少。

33. 2.4 正向反应与逆向反应 • LDH测定的选择目前尚有争议。 • 国内多采用正向反应（L→P），与IFCC在2001年发表的操作手册一致。 • 正向反应有利于LD1的活性表达，同时试剂成本低廉，稳定性好。 • 国外常用方法曾是逆向反应（P→L）， • 反应速度是正向的3倍，成本也较低。

34. 2.5 检测试剂的干扰作用 • 试剂酶的污染。 • 组织匀浆中往往含有NADH-细胞色素C还原酶，它将干扰各种还原酶的测定。 • 底物的非酶反应。 • 很多硝基酚的酯类衍生物在水溶液中不稳定，放置一段时间可自行水解释放出硝基酚。 • 如碱性磷酸酶（ALP）测定 • 解决的方法 • 是通过试剂空白管检出并加以校正。 • 选购IFCC或中华检验学会推荐的方法和质量好的试剂。

35. 3. 仪器因素的影响及控制

36. 3 仪器的影响因素 • 加样系统 • 加样的准确性、重复性和携带污染； • 反应系统 • 反应杯的形状、表面和携带污染； • 反应杯和反应槽温度的准确性、波动范围； • 搅拌和清洗机构的效果和携带污染； • 检测系统 • 光度计的准确性、重复性、线性范围和杂散光等均会造成结果的偏差。

37. 3 仪器影响因素的控制 • 在日常工作中，除常规做好仪器和设备的正确使用和维护外， • 重点应注意仪器的校准问题。

38. 3.1 酶活性浓度的计算公式 • 摩尔吸光系数  和系数 K 均为常数， •  和K受仪器诸多因素的影响， • 如波长的准确性、半波宽的大小、比色池光径及磨损与清洁度、温控的准确性、加样系统状况等。 •  和K 可用校准物定期校正。

39. 3.2 校准物 • 可用作酶活性测定用的校准物分两类。 • 一类是产物的基准物质， • 如对硝基酚、对硝基苯胺等， • 用于校准仪器的  值（摩尔吸光系数）。 • 另一类称酶校准物（Enzyme calibrator）， • 多是用人血清或动物血清作介质，与测定标本比较接近， • 用于校准仪器的 K 值（酶活性浓度定量系数）。

40. 3.2 校准物 • 国际上已经有经IFCC认可的CRM酶参考物。 • 各试剂供应商所提供的酶校正物的定值应可溯源至CRM酶参考物。 • 常规工作一般选用用于常规实验室的工作校准品。 • 目前，临床常规实验室应用较多的是德国宝灵曼公司的校准品(c.f.a.s)。

41. 3.3 ε的校准（340 nm波长） • NAD(P)H是酶活性测定中常用的指示辅酶。 • 在340nm的NAD(P)H的，可用葡萄糖己糖激酶法实测、计算其实测的。 • NAD(P)H的ε为6220。 • 如果6 000>ε>6600为不合格，则需找维修部检查。 • 注：干涉滤光片者需校准，光栅式可直接使用文献或试剂盒说明书的数值。

42. 3.3 ε的校准（405 nm波长） • 最常用的色素原为对硝基苯酚等。 • 对硝基苯酚在405 nm的，可用ALP测定试剂的缓冲液作为测定试剂，对硝基苯酚标准液作为血清标本，实际测定计算ε值。 • 对硝基苯酚的ε为18700。如果ε值偏差过大，则需找维修部检查。

43. 3.4 K的校准（公式计算法） • 将上述实测ε值代入K值计算公式得到校准K值外。

44. 3.4 K的校准（酶校准物） • 使用公认的酶校准物对K值进行校准，它是国际上目前酶测定标准化新途径。 • 使用酶校准物的优点， • 除具有实测ε值换算出的校准K值所具有的一切优点外， • 还可促进方法间的一致性和增加常规酶方法的可靠性，可使不同实验室之间的测定结果相对统一。

45. 3.4 K的校准（频率） • 最好（低）每半年进行一次酶活性的校准。 • 仪器在使用过程中，滤光片、加样系统的精度都可能发生变化，光学系统的灯泡、光电转换元件的老化、灵敏度变化等，都会导致测定结果的偏差。 • 但日常工作中，遇到下列情况时，必须进行校准： • 试剂盒改变厂家，或者更换了批号； • 仪器性能改变，如进行一次大的预防性维护或者更换了重要部件； • 质控反映出异常的趋势或偏移，或者超出实验室规定的接受限，采取一般性纠正措施后，不能识别和纠正问题时。

46. 4. 测定条件与参数设置

47. 4.1 最适条件包括 • ①合适的底物和最适底物浓度； • ②理想的缓冲液种类和最适离子强度； • ③反应液的最适pH； • ④最适反应温度； • ⑤合适的辅因子、激活剂浓度； • ⑥若是酶偶联反应，还需要确定指示酶和辅助酶的用量； • ⑦合理的测定时间，包括延滞期尽量短暂，有足够的线性期； • ⑧合适的样品与反应试剂的比例； • ⑨足够的检测范围； • ⑩尽量去除各种抑制剂等。

48. 4.2 反应温度 • 目前常规实验室越来越多的使用37℃，这更多地是从实际工作方便来考虑。 • 1986年以前，IFCC推荐酶活性测定的温度是30℃，纯镓的熔点为29.77℃，镓作为此温度的基准物质，保证了测定仪器在30℃的高度准确性。 • 2001年，IFCC正式发表了“37℃下检测酶催化活性浓度的IFCC一级参考方法操作手册和参考制品认可系统”，包括CK、LD、ALT、AST、GGT五个酶在内。

49. 酶活性与酶促反应温度的关系 4.2 反应温度

50. 4.3 延滞期、线性期的确定 • 延滞期的确定 • 延滞期可以因酶在样品中所存在的介质不同而略有差别，原因可能是存在内源性干扰物，也可能存在一些抑制剂。 • 确定原则是多观察浓度不等、病理情况不同的标本，选择延滞期最长者作为确定值。 • 线性期的确定 • 离不开酶浓度的可测上限，因为酶浓度越高，在同样时间内消耗底物越多，产生产物越多，底物的不足和产物的抑制将导致非线性期的提前到来。