1 / 38

اندازه گیری هموگلوبین A2

اندازه گیری هموگلوبین A2. مرکز تحقیقات آزمایشگاه های رفرانس دکتر خداوردیان.

belinda
Télécharger la présentation

اندازه گیری هموگلوبین A2

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. اندازه گیری هموگلوبین A2

  2. مرکز تحقیقات آزمایشگاه های رفرانس دکتر خداوردیان

  3. يكي از تست هاي تشخيصي مهم جهت تأئيد وجود بتا تالاسمي مينور تعيين درصد هموگلوبينA2 مي باشد . روش پيشنهادي با استفاده از كروماتوگرافي تعويض يونيMicro column است. كروماتوگرافي تعويض يوني از انواع كروماتوگرافي هاي مايع – جامد بوده كه بر اساس واكنش متقابل گروههاي باردار مولكول هموگلوبين و رزين ، جداسازي صورت مي گيرد. بر روي رزين يونهايي وجود دارد كه قابل تعويض با يونهاي همبار خود در هموليزات مي باشند. در اين روش از رزين آنيونيك دي اتيل امينواتيل سلولزDEAE52استفاده می شود

  4. اندازه گيري هموگلوبين - - - - - buffer resin filter - - - - - - - - - - -

  5. همولیزات رزین انیونیک DE52 تمایل به گرفتن بار منفی دارد . PH بافر ورزین پاین تر از IPهموگلوبین A2A2 در این PH بار مثبت پیدا می کند به صورت حلقه جدا میشود Hb A2 + Hb A - - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - - - Hb A2 +

  6. اساس روش: • تورم رزين با بافر و به تعادل رسيدن آن با بافر تا PH رزين به PH بافر برسد • اضافه نمودن هموليزات به ستون • جداسازي انتخابي اجراي نمونه بوسيله تغيير PH یا قدرت يونيك بافر ** در اندازه گيري هموگلوبين A2 به روش كروماتوگرافي ستوني مي توان از بافر گلایسين يا بافر تريس استفاده نمود.

  7. * رعايت نكات زير در هنگام اندازه گيري هموگلوبين A2 توصيه مي گردد : • 1- در صورتي كه ژل داخل ستونها تغيير رنگ داده باشند نبايد مورد استفاده قرار گيرند • 2- قبل از استفاده ازستونها و بافر بايد حتما" به دماي اتاق برسند. • 3- بهتر است از پي پت پاستور تميز و يا سمپلربا نوك نو جهت مخلوط نمودن رزين داخل ستونها با بافر و حل شدن حبابهای هواي داخل رزين استفاده نمود. • 4- ستونها بايد از يك Flow rate مناسب برخوردار باشند 1ml/4min،10-20ml/hour

  8. 5- قبل از تهيه هموليزات بايد نمونه خون تام كاملا" مخلوط شود 6-پس ازتهيه هموليزات بهتراست سريعتركروماتوگرافي انجام شود ( پس از ليز كامل گلبول هاي قرمز ) 7- قبل از نمونه گذاري به هيچ وجه نبايد رزين خشك شود. به محض اينكه محلول روِیی رزين خارج شد بايد هموليزات به ستون اضافه شود.8-از سمپلر کالبیره باید جهت برداشت نمونه خون، بافرو همولیزات استفاده نمود.

  9. 9-باید از لوله های مدرج استاندارد جهت جمع اوری هموگلوبین A2 از ستون و تهیه لوله توتال استفاده نمود.در صورت عدم دسترسی به لوله های فوق لوله های معمولی را به روش دستی (قلم الماس ،ماژیک) مدرج نمائید.10- افزودن هموليزات بايد به آرامي و درست در سطح رزين صورت گيرد و سطح آن نبايد در هنگام نمونه گذاري آسيب ببيند. 11- بهتراست از يك نوك سمپلر جهت ریختن هموليزات بداخل ستون و لوله توتال استفاده شود .

  10. 12- به محض جذب شدن هموليزات برروی رزين بايدبلافاصله بافر اضافه شود13- اگر قبل از جذب كامل هموليزات برروی رزين، محلول بافر ريخته شود باعث كاهش كاذب هموگلوبين A2 مي گردد. 14- بايد دقت شود تمامي بافر اضافه شده از ستون خارج شود.15- قبل از خواندن جذب نوري ، بايد لوله A2 و توتال كاملا" مخلوط شوند.

  11. 16- بايد از يك اسپكتروفتومتر كاليبره جهت خواندن جذب نوري لوله ها استفاده شود.17- بهتر است از نمونه كنترل صحت تجاري در هر سری كاري استفاده شود در صورت عدم دسترسي، يك نمونه که هموگلوبين A2 آن مشخص شده است به عنوان نمونه كنترل گذاشته شود.

  12. - این متد برای اندازه گیری هموگلوبین A2 اختصاصی نیست بطوری که بسیاری از هموگلوبین های همبار با هموگلوبین A2نیز از ستون خارج می شوندکه شامل هموگلوبین C,E,O arab و بعضی از واریانت های هموگلوبین A2 (A'2)و زنجیره دلتا میباشند. لذا هموگلوبین A2از این هموگلوبین ها قابل تفکیک نیست. • - در مواردی که هموگلوبین A2 بیشتر از 7% می باشد باید به وجود هموگلوبین های C,E,O arab شک نمودکه همراه با هموگلوبین A2از ستون خارج می شوند.در این مورد نیاز به بررسی تکمیلی نظیر الکتروفورز هموگلوبین در PH=8.4و PH=6-6.2 و بررسی فامیلی می باشد. • - اگر همه همولیزات اضافه شده یکباره از ستون پاِیین آید ،باید به وجود سایر هموگلوبینوپاتی ها شک نمود. بیمار هموگلوبین S یا Dو G و یا هموگلوبین E,C دارد. • - اندازه گیری هموگلوبین A2به روش کروماتوگرافی ستونی نباید در بیمارانی که اخیرا خون دریافت کرده اند صورت گیرد.

  13. βThal. With Normal HbA2: 1-Heterozygotes with N. A2 βThal. (type1) HbA2 N,Indices N.or ↓(silent βThal. ) 2- βThal +Delta Thal. (Type2) Indices↓. HbA2 N, HbF↑ • Double Hetro. For α & βThal. MCV N., MCH ↓or border line,Hb A2 about 3.2 ► DNA Study

  14. ٍELECTEROPHORESIS Dr. K. Khodaverdian ElECTEROPHORESIS Your Text Here

  15. ALKALINE ELE. • Principle:Electrophoresis is the movement of charged particles within an electrical fields.At PH 8.4 Hbs are negatively charged anions →Anod * Supporting Media : Cellulose(Acetate cellulose) Gel(agarose polyacrylamide,starch) * Sample: Hemolysate (Hb→20-30g/l) * Equipment: Chamber,Power Supply,Cellulose AcetateMedium,Applicator * Reagents: 1- Buffer: TEB →pH 8.4-9.2

  16. 2-Stain: non specific→Panceau S Specific →o-tuluidine,o-dianisidine 3-Destaining →5%acetic acid -Dehydration →Methanol -Clearing

  17. Errors • Cloudy or cont. Buffer • Buffers of improper PH or ionic strength • Cont.of sample wells, applicator ,blotter…… • Cloudy or old hemolysate metHb→5%KCN • Improper presoaking&blotting of cellulose strips • Delay in applying Sample • Improper placement of sample • Leukocytosis →Anodal than Hb H (leu. Myeloperoxidase) • GlycoHb →band Anodal to Hb A

  18. + - H,I,J A F Lepore,S,D,G A2,C,E,O CA

  19. Anode(+) ……..C C-Harlem......... S ………. O arab .......................Origin D,E,G,Lepore,H,I,N, ............A Barts .............F ( Cathode(-

  20. Anode Catode + H Oarab A2,C,E A F S,DG CA Origin A PH= 8.6 C Anode A,D,E,G,H Catode origin S,C-harlem O-arab F,Barts PH=6

  21. HPLC • Cation Exchange Choromatography interchange of charge group on the ion exchange material(negatively stationary charge)with charge group on Hb (positively charge)molecule. • Adventages: -Automated -Very small sample are sufficent -Quantification of N.&Var. Hb are available

  22. Disadvantage: -expensive -Co-elute some variants together HPLC Usually separates HbA,A2,F,S,C,D,&G from each other. Hb E&Lepore co-elute with Hb A2.

  23. GUIDELINES FOR INTERPRETAION A1a -A1b –F -LA1C/CHb -A1C –P3 - A0 -A2- S –C -Total Area of Each Analysis:1.0-4.0 millvolt/sec -Quality Control Values are in Ranges -Reportable Range: A1c:3.7%-18.4%- A2:1.5%-11.4% - 0.8%-16.5% out of range→(*) A1c out side of reportable range should not report A2&F →less than 1.5%or less than 1% greater than 11.4% or16.5%

  24. Limitation - HbF>16.5%, HbF may elute in LA1c/CHb or A1c window and no Hb F will report. - HbA1c >18.4% should be tested for possible of Hb Variant interference -Hb A2>10 % should be tested for possible presence of Hb Var. Hb D &Hb E are coelute with Hb A2 -Hb E samples may generate carry over in the subsequent injection

  25. - A degradation peaks may coelute with the HbA2 peak when samples contains Hb S which have not been stored appropriately review HbA2 peak shape for all Hb S samplesbefore report • - A degradation peaks may interfere with the measurement HbA1c when samples contains varients D &E have not been stored appropriately . do not report A1c result if an unKnown peak is identified between A1c& P3 • Samples with Hb varients should be checked for Hb A2&A1c peak shape.

  26. Typical E-Beta thal Sample: high F peak shifted to La1c/Chb window HbA2>10% (HbE)

  27. HbF: 1.0%; HbA: 38.7%; HbA2: 4.4%; HbS: 56.1% Sickledex is POSITIVE; Peripheral smear with 2+ sickle cells

  28. Solubility test • Sickling Hb, in deoxygenated state (dithionite Na2S2O4) is insoluble & forms a precipitate at high molarity Phosphate buffer • Test not specific for Hb S,Report :Pos or Neg . Pos test did not distinguish Hb AS,SS, S/β+ …. • Sample: whole blood →packed cell • Control: Pos. Control About 30-45% Hb S,

  29. Source of error • Inactive or out date reagent • False negative result: Anemia,infant<6 months, resent transfusion • Improper Tem.of Reagents • Improper mixing of the specimen with Reagent • Improper interpretation of the reader scale • False Posative result:persons with paraproteinemia,hyperlipidemia, leukcocytosis Unstable Hb (after spleenectomy ,Heinz body

  30. Sickle cell anemia: • In sickle cell trait, usually see HbS concentrations of 35 to 45% of total Hemoglobin because the HbS has a slower rate of synthesis than HbA • If HbS is less than 33%, start thinking about S-alpha-thalassemia • If HbS is greater than 50%, worry about S-Beta-thalassemia or Sickle cell disease with transfusion

  31. Expected ratios

  32. Hb F • alkalane denaturation (bethke) Hb F 2-40% • Column chromatograpy HbF >40% • Immunological methods H b <2% • Hb→ HICN →NaoH →Hb denaturation →Amonium sulfate (stop solution ,↓PH precipitates the denature Hb) filtered→ Hb F measured at 540 nm

  33. Difference of duplicate: 0.5%→ HbF 0-5% 1% → HbF 5-15% 2% → HbF >15% • Final concenteration of NaoH & Amonium sulfate solution are critical

More Related