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Contrôle de la mort cellulaire par la voie des MAPK1/3

Contrôle de la mort cellulaire par la voie des MAPK1/3. Sébastien Cagnol. Institut de Signalisation, Biologie du Développement et Cancer CNRS UMR6543. Equipe du Dr Ellen Van Obberghen-Schilling. Sous la direction du Dr Jean-Claude Chambard. La mort cellulaire programmée ou Apoptose.

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Contrôle de la mort cellulaire par la voie des MAPK1/3

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  1. Contrôle de la mort cellulaire par la voie des MAPK1/3 Sébastien Cagnol Institut de Signalisation, Biologie du Développement et Cancer CNRS UMR6543 Equipe du Dr Ellen Van Obberghen-Schilling Sous la direction du Dr Jean-Claude Chambard

  2. La mort cellulaire programmée ou Apoptose Permet l’auto-élimination physiologique des cellules Mécanisme présent au sein de chaque cellule Conservée au cours de l’évolution

  3. La mort cellulaire programmée ou Apoptose Au cours du développement embryonnaire Remodelage des tissus Dans l’organisme adulte Maintien de l’homéostasie cellulaire et tissulaire Renouvellement de certains tissus

  4. L’apoptose pathologique Excès de mort cellulaire Maladies neurodégénératives Destruction tissulaire brutale (ischémie, hépatite) Défauts de mort cellulaire Maladies Autoimmunes Cancer

  5. Les caspases   procaspases dimérisation clivage auto-protéolytique  caspases initiatrices  caspases effectrices

  6. condensation cellulaire corps apoptotiques Les caspases caspases effectrices Fragmentation de l ’ADN et du noyau Modifications du cytosquelette Inhibition du potentiel mitochondrial Réorganisation de la membrane plasmique

  7. L’activation des caspases récepteurs de mort Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques FADD mitochondrie procaspase8 Bid cytochrome c Apaf1 caspase8 caspases effectrices 3,6,7 caspase 9 procaspase9 Apoptosome

  8. La voie mitochondriale Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques mitochondrie cytochrome c Apaf1 procaspase9 Apoptosome

  9. La voie mitochondriale Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques mitochondrie cytochrome c Apaf1 procaspase9 Apoptosome

  10. La voie mitochondriale Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques mitochondrie cytochrome c Apaf1 caspases effectrices 3,6,7 caspase 9 procaspase9 Apoptosome

  11. Les récepteurs de mort récepteurs de mort Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques FADD mitochondrie procaspase8 DISC cytochrome c Apaf1 caspases effectrices 3,6,7 caspase 9 procaspase9 Apoptosome

  12. Les récepteurs de mort récepteurs de mort Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques FADD mitochondrie procaspase8 cytochrome c Apaf1 caspases effectrices 3,6,7 caspase 9 procaspase9 Apoptosome

  13. Les récepteurs de mort récepteurs de mort Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques FADD mitochondrie procaspase8 Bid cytochrome c Apaf1 caspase8 caspases effectrices 3,6,7 caspase 9 procaspase9 Apoptosome

  14. survie apoptose Facteurs de survie matrice extracellulaire sérum cellules en prolifération

  15. Jaks Les voies de survie Facteurs de survie AMPc Raf PI3K MEK AKT PKC MAPK NFB PKA Survie cellulaire Croissance cellulaire Prolifération cellulaire Différenciation cellulaire

  16. P P P P P P La voie des MAPK1/3 Récepteurs tyrosine kinase Intégrines Récepteurs couplés aux protéines G Ras Ras Raf-1 GTP GTP B-Raf MEK1/2 Prolifération KSR Différenciation MAPK1/3 Migration cellulaire Survie cellulaire Substrats cytosoliques MAPK1/3 Substrats nucléaires

  17. P P P P MAPK1/3 Le contrôle de l’activité des MAPK Raf1 MEK1/2 Forme active phosphorylée Forme inactive déphosphorylée MAPK1/3 MAPK Phosphatases (MKP 1,2,3)

  18. P P MAPK1/3 L’enlèvement du sérum inhibe les MAPK tamoxifène : sérum : + - Raf1 pMAPK1/3 MAPK1 MEK1/2 Forme active phosphorylée Forme inactive déphosphorylée MAPK1/3 MAPK Phosphatases (MKP 1,2,3)

  19. P P P P MAPK1/3 L’activation de Raf-1:ER maintient les MAPK actives tamoxifène tam + tamoxifène : sérum : + - - Raf1 pMAPK1/3 tam MAPK1 ER Raf1 MEK1/2 Raf-1:ER MAPK1/3 MAPK Phosphatases (MKP 1,2,3)

  20. apoptose survie sérum Les fibroblastes CCL39 Raf-1:ER contraste de phase iodure de propidium + sérum

  21. Les fibroblastes CCL39 Raf-1:ER tam ER Raf1 apoptose survie MAPK sérum apoptose contraste de phase iodure de propidium contraste de phase iodure de propidium L’activation de Raf:ER protège les cellules CCL39 contre la mort induite par enlèvement de sérum et d’ancrage (Le Gall. MBC 00 11,1103)

  22. La voie des MAPK inhibe l’apoptose mitochondriale CCL39 Raf-1:ER enlèvement de sérum ( h ) -sérum 24h 0 3 6 9 12 24 tamoxifen (1M) : - - + PARP PARP CCL 39 p-MAPK CCL 39 BclxL PARP MAPK1 BclxL mitochondrie PARP caspase 3 caspase 9 PAR P

  23. sérum • + tam contrôle - sérum (14h) La voie des MAPK inhibe l’activité et l’activation de caspase 9 enlèvement de sérum (h) : 0 6 9 14 24 tamoxifène : - - + - + - + - + procaspase 9 caspase 9 p37 p35 p-MAPK MAPK1 300 250 200 activité caspase 9 150 100 50 0

  24. L’apoptose mitochondriale mitochondrie tam ER Raf1 MEK1/2 cytochrome c MAPK1/3 Apaf1 caspases effectrices 3,6,7 caspase 9 procaspase9 Apoptosome

  25. La voie des MAPK ne bloque pas la sortie du cytochrome c contrôle - sérum (14h) - sérum + tam * * cytochrome c * * caspase-3 activée * * * dapi * *

  26. Etude de la multimérisation d ’Apaf-1 par chromatographie d ’exclusion lysat cellulaire mAU 100 2.000 kDa 12000 443 80 60 colonne 150 669 40 200 20 Apaf1 0 fractions protéiques 1 5 10 15 Fractions : Apoptosome

  27. La voie MAPK ne bloque pas l ’oligomérisation d ’Apaf1 M (kDa) 669 443 200 r Fractions : 1 5 10 15 Apaf-1 contrôle cytochrome c Apaf-1 - sérum cytochrome c Apaf-1 - sérum + tamoxifène cytochrome c

  28. La voie des MAPK ne bloque pas le recrutement de caspase 9 dans l ’apotosome Mr (kDA) 669 443 200 150 66 Fractions : 1 10 20 30 caspase 9 contrôle caspase 9 - sérum - sérum + tamoxifène caspase 9

  29. La voie des MAPK ne bloque pas le recrutement de caspase 9 dans l ’apotosome Mr (kDA) 669 443 200 150 66 Fractions : 1 10 20 30 caspase 9 contrôle caspase 9 - sérum - sérum + tamoxifène caspase 9 1 10 1 10 1 10 Fractions de haut poids moléculaire concentrées caspase 9 contrôle - sérum - sérum + tamoxifène

  30. L’apoptose mitochondriale mitochondrie tam ER Raf1 cytochrome c MEK1/2 MAPK1/3 Apaf1 caspases effectrices 3,6,7 caspase 9 procaspase9 Apoptosome

  31. P P P P La protection par Raf1:ER est-elle dépendante des kinases MEK/MAPK ? tam ER Raf1 MEK1/2 ? caspase 9 MAPK1/3

  32. P P P P La protection est-elle dépendante des kinases MEK/MAPK ? tam ER Raf1 U0126 MEK1/2 ? caspase 9 MAPK1/3

  33. L’inhibition du clivage de caspase 9 dépend de l’activité MEK +S -S -sérum (24h) + tam tam ER Raf1 U0126 (µM) : 0 0.3 1 3 10 caspase 9 MEK1/2 U0126 p-MAPK MAPK1/3 MAPK1 sérum : 5% 1% sérum U0126 : 0 10 0 3 10 apoptose MAPK caspase 9 p-MAPK

  34. L’activité MEK est nécessaire de façon continue - sérum + tamoxifène (24hr) + S - S addition retardée de U0126 : 0 4 6 8 10 12 14h caspase 9 tam ER Raf1 MEK1/2 U0126 MAPK1/3

  35. P P P P La protection est-elle dépendante de l’induction d’une protéine antiapoptotique ? tam ER Raf1 MEK1/2 caspase 9 MAPK1/3 ? protéine antiapoptotique

  36. P P P P La protection est-elle dépendante de l’induction d’une protéine antiapoptotique ? tam ER Raf1 MEK1/2 caspase 9 MAPK1/3 ? émétine protéine antiapoptotique

  37. L’effet protecteur de la voie MAPK dépend de la synthèse protéique + S - sérum + tamoxifène (24hr) - S addition retardée d’émétine : 0 2 4 6 8 h caspase 9 p-MAPK MAPK1  L’inhibition de caspase 9 dépend de mécanismes traductionnels et post-traductionnels

  38. Le mécanisme de protection ne dépend pas de la phosphorylation de caspase 9 sur son résidu T125 P P MAPK1/3 P PETP caspase 9 N C 125 Allan et al, Nat Cell Biol 2003 5,647 - sérum NT tamoxifène : - - - + + caspase 9 T125A p-MAPK

  39. Conclusions L’activation de la voie des MAPK inhibe le clivage de caspase 9 L’activation de la voie des MAPK n’empêche pas la formation de l’apoptosome L’effet protecteur dépend de mécanismes traductionnels et post-traductionnels

  40. P P P P MAPK1/3 Quel est le mécanisme d’inhibition ? -sérum 24h tamoxifen : - - + caspase 9 mitochondrie tam ER Raf1 XIAP MEK1/2 IAPs caspases effectrices 3,6,7 caspase 9 procaspase9 Apoptosome

  41. Rôle antiapoptotique de la voie MAPK dans les tumeurs Mutation de B-Raf ? Inactivation de l’apoptosome MAPK1/3 Développement tumoral

  42. Le MAPK paradoxe

  43. L’activation des MAPK induit la mort cellulaire

  44. Stimulation de la voie des MAPK dans les cellules HEK293 Raf1-ER stimulation au sérum tamoxifène expo stimulation (min) : 0 5 10 30 60 0 5 10 30 60 p-MAPK MAPK1

  45. L’activation prolongée des MAPK induit la mort des cellules HEK293 contrôle tamoxifène 24h tamoxifène 48h iodure de propidium

  46. L’activation prolongée des MAPK induit l’ apoptose des cellules HEK293 50 40 30 ADN sub-G1 (%) 20 10 0 tamoxifène ( h ) : 0 24 48 72 ZVAD tam (48h) : - + - + tamoxifène ( h ) : 0 13 18 24 30 40 48 72 PARP PARP p-MAPK MAPK1

  47. L’apoptose dépend de l’activité MEK et de la synthèse protéique U0126 10 M CHX 1 g/mL tamoxifène 48h (1M) : - + - + - + PARP p-MAPK MAPK1 Cycloheximide (CHX) = inhibiteur de la synthèse protéique

  48. Une protéine apoptotique est accumulée durant les premières heures 40 35 30 25 clivage de PARP (%) 20 15 10 5 0 tamoxifène (48h): - + + + + + 10 14 24h 0 addition retardée de cycloheximide

  49. L’apoptose dépend d’une activation continue de la voie MAPK 40 35 30 25 clivage de PARP (%) 20 15 10 5 0 tamoxifène (48h): - + + + + + 10 14 24h 0 addition retardée de U0126 après

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