PROTEAZOMY

1. PROTEAZOMY Zuzana KAUEROVÁ 4.r. biochemie 2004/2005

2. 1. Když se řekne proteazom • Velké membránové multipodjednotkové komplexy, obsahující proteázy • Hlavní úkol: degradace intracelulárních proteinů • Výskyt: jádro a cytoplazma nejen u eukaryotních buněk, ale i u archebakterií (Thermoplasma acidofillum)

3. 1.1. Historie • Poprvé objeveny americkými vědci Sherwinem Wilkem a Marianem Orlowskim, členy farmakologické fakulty Mount Sinai School of Medicine v roce 1980, jako komplexy endopeptidáz, izolované ze srdce pacienta postiženého hypertrofií srdce

4. V roce 1988 vědec Arrigo prokázal, že tento systém proteáz, nazývaný dosud MPC (multikatalytický proteázový komplex) je identický s již objevenou částicí – prozomem (objeven německou skupinou Klause Scherrera) • Prozom přejmenován na oficiální název proteazom

5. 1.2. Hlavní funkce • Odstraňují abnormální proteiny z buňky • Podílejí se na reakcích na stresové situace degradací proteinů, označených ubikvitinem (Ub) • Jako součást Ub systému se zapojují do regulace buněčných procesů • Kontrolují diferenciaci buněk (degradují transkripční faktory a metabolické enzymy) • Velkou roli hrají v imunitním systému, kde vytváří peptidy MHC glykoproteinů I. třídy

6. 2. Proteinová degradace • Nově objevený mechanizmus buněčné regulace • Hlavní výhoda proteolýzy – rychlost, umožňující buňce rapidní redukci hladiny určitých proteinů • Nevratný děj – kompletní ztráta funkcí • Základní požadavek: vysoká specifita

7. 2.1. Ubikvitinace • Nejobecnější způsob označování proteinů k degradaci v proteazomech • Připojení řetězce ubikvitinu o 76 aminokyselinách • Katalýza: - E1 aktivující enzymy - E2 konjugační enzymy - E3 vazebné enzymy (pouze v některých případech)

8. Proces degradace s ubikvitinem: Ubikvitin je aktivován vytvořením thiosterové vazby s aktivačním enzymem E1. Ubikvitin je pak přenesen do aktivní cysteinové skupiny konjugačního enzymu E2, který ubikvitin naváže na aminoskupinu zbytku lyzinu substrátového proteinu. Pro tento proces je v některých případech nutná kooperace s enzymem E3. Opakovaná konjugace ubikvitinu s lyzinovými zbytky vede ke vzniku multiubikvitinových řetězců, které, navázané na substrátový protein, jsou rozeznány a degradovány v proteazomech. Multiubikvitinový řetězec se uvolní z komplexu a ubikvitin je recyklován.

9. http://www.cytomics.fr/html_uk/m2_1.html

11. 2.2. Další způsoby označení proteinů k degradaci • „PEST sekvence“ = degradační signály (obsah v prolinu, kys. aspartové a glutamové, serinu a threoninu) Vymazání PEST sekvence => stabilita • Neoznačené proteiny obsahují „destrukční boxy“ – silně zakonzervované aminokyseliny, navozující signál k degradaci

12. 3. Struktura proteazomů • 2 části: • 20S proteazomjádrem větší částice 26S proteazomu • Oba komplexy existují v dynamické rovnováze • Hlavní rozdíl: 26S proteazom degraduje ubikvitinované proteiny, 20S proteazom ne

13. 3.1. 20S proteazom3.1.A Struktura • Často demonstrován na 26S proteazomu archebakterie Thermoplasma acidofillum – téměř identické s 20S proteazomy všech eukaryot • Dutý cylindr, molekulová hmotnost 700 kDa • Velké množství nízkomolekulárních podjednotek (25 – 35 kDa), 2 typy: α a β • Uspořádány do 4 prstenců, každý o 7 podjednotkách

15. Délka cylindru – 148 podjednotek (15 nm) Výška cylindru – 113 podjednotek (11 nm) • Vytváří kanál se 3 velkými výdutěmi (šířka 0,13 nm): 1. Dvě vnější výdutě na povrchu formovány α a β prstenci 2. Centrální výduť formována beta prstenci = centrum proteolytické aktivity Přístup do tohoto centra kontrolován 4 úzkými bránami (vnější brána, která je vytvářena α podjednotkami, propouští pouze otevírající se 113ti jednotkový průměr)

16. RRozdíly mezi α a β podjednotkami minimální • PPouze: α podjednotka vytváří strukturu α helixu napříč vrchní částí = součást výdutě, napomáhá transportu substrátových proteinů do centrálního kanálu • NNezralá β podjednotka obsahuje N-terminální konec (Thr), který ji inaktivuje (funguje jako samostatná jednotka) => odstřihnutím => proteolyticky aktivní (ochrana před neadekvátní proteolýzou v cytoplazmě)

18. Obr.: Proteazom na gelu a v elektronovém mikroskopu

19. http://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/proteasome.html

20. 3.1.B Funkce • 20S proteazom je jádrem proteinové degradace • Reprezentuje unikátní typ proteáz – threonin proteázu • Působí při degradaci řetězce A a B v inzulínu • Oxiduje proteiny in vitro • Veškeré procesy katalýzy probíhají uvnitř komplexu beta podjednotek

21. 3.2. 26S proteazom3.2.A Struktura • Na rozdíl od 20S proteazomů, které in vitro degradovaly pouze určité proteiny denaturací či oxidací za nepřítomnosti ATP, 26S proteazomy degradují ubikvitinové konjugáty v reakci závislé na ATP • 26 proteazom = velký proteázový komplex,cca 1700kDa • Struktura typická jako pro 20S proteazom, ale se dvěma přídavnými podstrukturami navázánými na oba konce = 19S části , tzv. „víčka“

22. 3.2.B 19S struktura • Asociována s 20S proteazomy na ATP závislým způsobem • 19S víčka jsou prostředníkem mezi ubikvitinovým systémem a 26S proteazomem • Složena z 20 různých podjednotek (25 – 110 kDa) • Dosud přesně určeno pouze 6 podjednotek 19S struktury s ATPázovou aktivitou, které vytváří prstenec, sousedící s výdutí, ohraničenou α podjednotkami

23. 3.2.C Funkce 19S víček • Slouží k zachycení a přitáhnutí označeného proteinu do proteazomu • Hydrolýza ATP je spojena se vstupem označeného proteinu do proteolytického centra, přesný mechanizmus však není znám • 19S struktura se nevyskytuje u archebakterií, typický pouze pro eukaryota

24. 3.2.D Funkce 26S proteazomu Plní životně důležité funkce: • kontrola buněčného cyklu • buněčná diferenciace • regulace metabolických drah • role ve stresových situacích • odstraňování abnormálních proteinů

25. Kontrola buněčného cyklu • Cyklus dělení eukaryotických buněk kontrolován cyklin-dependentními protein kinázami (CDK) • Vznik a zánik dílčích aktivovaných kinázových komplexů během různých fází buněčného cyklu regulován syntézou a proteolytickou degradací specifických cyklinů v proteazomech • Inhibitory CDK jsou také kontrolovány proteolytickou destrukcí: cyklinová degradace potřebná pro zastavení aktivace CDK, proteolýza CDK inhibitorů=> přepnutí CDK aktivity

26. Stresová odpověď imunitního systému • Prostřednictvím NF-B = regulátor transkripce velkého množství genů, zapojujících se do imunitních a zánětlivých reakcí • Tyto geny kódují zánětlivé a chemotaktické cytokiny, hematopoetické růstové faktory, adhezivní molekuly, protilátky, MHC glykoproteiny I. třídy a receptory pro cytokiny • NF-B silně regulovaný a aktivovaný širokou směsicí většinou patogenních stimulů (např. viry, bakteriemi, energeticky bohatou radiací, oxidanty a zánětlivými cytokiny TNF- a IL-1)

27. V aktivní formě je NF-B heterodimerní komplex, 2 podjednotky: p50 podjednotky (NF-B1) a p65 podjednotky (Re1A) • => inaktivace dvěma různými mechanizmy: • asociace proteinového inhibitoru I-B s  p50-p65 komplexem • syntéza NF-B1 - prekurzorového 105ti kilodaltonového proteinu, který se sice může kompletovat s p65 podjednotkou, ale nevytváří aktivní komplex.

28. Proteazomy jsou zodpovědné za aktivaci NF-Bdegradací proteinu I-B a převedením 105ti kilodaltonového prekurzoru NF-B na p50 aktivní formu • Proteazomy tedy nejsou pouze zodpovědné za kompletní degradaci proteinů, ale také jsou nezbytné pro aktivaci proteinů při procesu aktivace prekurzorů.

29. Antigenní prezentace • Proteazomy mohou syntetizovat krátké peptidové fragmenty => prezentovány na povrchu lymfocytů v MHC komplexu glykoproteinů • Hrají důležitou roli ve schopnosti buněk reagovat na stresové situace • V buňkách imunitního systému jsou některé βpodjednotky nahrazeny gamma-interferon indikačními homology, které zvyšují efektivnost degradace v proteazomech (struktura téměř stejná)

31. 4. ZÁVĚR • Proteazomy mohou být považovány za funkčně propracované doplňky ribozomů. Regulace hladiny proteinů destrukcí prostřednictvím proteazomů je nezbytný nástroj buňky. Je zřejmé, že několik dodnes objevených substrátů v proteazomech reprezentují pouze špičku ledovce. Přesto jsou však velkou výzvou k objevu všech buněčných procesů, které se v proteazomech odehrávají, stejně tak jako detailní mechanizmy, zdůrazňující tyto selektivní procesy.