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第十七章 基因重组与基因工程 (genetic recombination and genetic engineering). 基因重组 是指在体外用酶学方法将不同来源的 DNA 进行切割、连接,组成一个新的 DNA 分子的过程,又称 DNA 重组。 基因克隆 将重组 DNA 分子导入到合适的受体细胞中,使其扩增和繁殖,以获得大量的同一 DNA 分子,称此为基因克隆、 DNA 克隆或分子克隆。 基因工程 实现基因克隆所采用的方法和相关工作,统称为重组 DNA 技术或基因工程。. 本章主要内容 重要的工具酶
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第十七章 基因重组与基因工程(genetic recombination and genetic engineering)
基因重组 是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接,组成一个新的DNA分子的过程,又称DNA重组。 基因克隆 将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中,使其扩增和繁殖,以获得大量的同一DNA分子,称此为基因克隆、DNA克隆或分子克隆。 基因工程 实现基因克隆所采用的方法和相关工作,统称为重组DNA技术或基因工程。
本章主要内容 重要的工具酶 基因克隆常用的载体 重组DNA基本原理 重组技术在医学和制药 工业中的应用
第一节 重要的工具酶 工具酶 基因工程中的工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、修饰、反转录等有关的各种酶系统。
一、限制性核酸内切酶(RE) 是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键 的核酸内切酶,简称限制酶或切割酶。 根据限制酶的作用特性,一般分为三类: ——Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型, 其中常用的是Ⅱ型限制酶。
限制酶(Ⅱ型)识别及切割位点 特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断,主要产生3种缺口: 5ˊ-粘性末端 3ˊ-粘性末端 平端或钝端 回文序列 是指该部位的核苷酸序列呈180O旋转对称; 粘性末端 是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ-末端突出或3ˊ-末端突出的碱基序列相互具有互补性。
⑴ 产生5'-粘性末端 ⑵ 产生3'-粘性末端
⑶ 产生平(头末)端/钝端 同裂酶(异源同工酶) 同尾酶 可变酶 其它特殊性质 的Ⅱ型限制酶
同裂酶 又称异源同工酶。指来源不同,但具有相同的识别序列。 在切割DNA时,其切割点可以是相同的,产生平头末端,称为同识同切; 切割点也可以是不同的,产生3ˊ或5ˊ粘性末端,称为同识异切。
同 尾 酶 同尾酶 指来源不同,但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。
可变酶 可变酶 识别顺序中的一个或几个碱基是可变的, 并且识别顺序往往超过6个碱基对。 如, BstpⅠ,其识别顺序为GGTNACC。
二、DNA聚合酶 (最常用的DNA聚合酶有以下4种) DNA聚合酶Ⅰ DNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段 Taq DNA聚合酶 T4 噬菌体DNA聚合酶
㈠ DNA聚合酶Ⅰ E.ColiDNA聚合酶Ⅰ(DNA pol Ⅰ) 是一个具有 3 种酶活性的多功能性酶。 包括: 5ˊ→3ˊDNA 聚合酶活性 5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性
DNA pol Ⅰ应用 ⑴ 催化DNA缺口平移反应,制备高比活性DNA 探针; ⑵ 第二条cDNA链的合成; ⑶ 对DNA3’突出末端进行标记; ⑷ DNA序列分析。
Klenow片段用途 ⑴ 补齐双链DNA的 3ˊ末端; ⑵ 用标记碱基补 齐3ˊ末端 ; ⑶ 在cDNA克隆中, 用于第二股链 的合成; ⑷DNA序列分析。
㈢ Taq DNA pol(耐热DNA聚合酶) 作用特点 1) Taq DNA pol催化DNA合成的最适温度范围 70 75℃, 2) 95℃以上高温,半小时不失活, 3) 最适合用于聚合酶链反应(PCR)。
三、逆转录酶 特点 逆转录酶是一个多功能性酶,至少具有以下3种酶 活性: ⑴ 以单链RNA 为模板, 催化合成cDNA单链 ⑵ 具有RNase H 活性,能水解RNA:DNA杂交链中的 RNA ⑶ 以DNA为模板,催化合成cDNA双链。
逆转录酶的应用: ⑴ 将mRNA逆转录成cDNA,构建cDNA文库; ⑵ 补平和标记5ˊ-末端突出的DNA片段; ⑶ 代替Klenow酶用于DNA序列分析; ⑷ 制备杂交探针等。
T4DNA连接酶 DNA连接酶可以 催化带有粘性末端或平头末端的双链DNA中一条链的3ˊ-OH与另一条链的5ˊ-PO3H2形成磷酸二酯键而相连,从而构成一条完整的DNA长链。 DNA连接酶的用途 (1) 两个双链DNA片段连接起来 5ˊ- ACG AATTCGT-3ˊ T4DNA连接酶5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ 3ˊ- TGCTTAA GCA-5ˊ 3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ (2) 修补带有缺口的双链DNA分子 四、DNA连接酶(DNA ligase)
五、碱性磷酸酶 碱性磷酸酶(BAP) 能够催化水解去除DNA或RNA5ˊ-端的磷酸基团。 用途 ⒈ 制备载体时,用碱性磷酸酶处理去除载体分子 5ˊ-端磷酸基后,可防止载体自身环化连接,提高重组效率。 ⒉ 用32P标记5'-端前,去除5'-P,再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5'-端进行标记。
六、末端 (脱氧核苷酸)转移酶(TdT) 作用 将标记或未标记的dNTP加到DNA的3ˊ—OH末端;也可催化载体分子或待克隆的DNA片断上加上互补的同聚尾,便于进一步连接。 应用 ① 探针标记 P32-α.dGTP G32G32G32G32 G32G32G32G32 ② 在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾,以便于进行连接
载体(vector) 是将外源DNA(目的DNA)片断引入宿主细胞的运载工具,其化学本质为DNA 。 本节主要内容 载体必须具备的基本条件 载体的种类 常用的载体 第二节 基因克隆常用的载体
一、载体必须具备的基本条件 ⒈ 有自身的复制子,能独立复制 ⒉ 具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点) ⒊ 具有遗传表型或筛选标记 ⒋ 有足够的容量以容纳外源DNA片段。 ⒌ 表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动 子、前导序列、增强子等调控元件。 ⒍ 载体DNA中均有一段非必需区,将外源基因插入 该非必需区,而载体本身不受影响。
二、载体的种类* (一) 克隆载体 用来克隆和扩增DNA片段的载体,具有3点共性: ⑴ 能够在受体细胞复制; ⑵ 带有药物抗性基因,便于筛选; ⑶ 可导入受体细胞。 (二)表达载体 除具有克隆载体所具有的性质外,还带有表达构件——转录和翻译所必须的DNA顺序。
(一) 质粒 (plasmid): 是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分子。 作为克隆载体的质粒应具备以下特点: 1. 分子量相对较小,能稳定存在于细菌体内, 有较高的拷贝数 2. 具有1个以上的遗传标志,便于筛选 3. 具有多克隆位点 三、常用的载体
总而言之,质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的“松弛型”质粒,且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。总而言之,质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的“松弛型”质粒,且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。 广泛应用的质粒: pBR32质粒、pUC系列等
pBR322质粒 ① 4363 bp ② 含一个复制点 • 含一个抗氨卞青霉素标 记(ampR) ④ 一个抗四环素标记 (tetR) ⑤ ampR和tetR基因内各有一些限制酶的酶切位点,供外源基因插入 当外原基因插入抗药基因位点时,AmpR→Amp敏感(AmpS )、TetR→Tet敏感(TetS).
pUC系列质粒 由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体; (1) 2674bp; (2) 有ampr和与M13噬菌体 相同的多克隆位点(MCS) (3)有一个来自大肠杆菌的LacZ操纵子的DNA片断, 编码半乳糖苷酶
(二)λ噬菌体 组成特点: 双链线状DNA分子, 全长50kb, 含65个基因, 在其分子两端各含有12个碱基的互补单链,是天然的粘性末端,被称为COS位点。
λ噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长λ噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长 溶菌性生长(lytic pathway) 噬菌体感染细菌后,借助其2个COS位点互补成环,在宿主菌体内连续复制,合成大量基因产物,进而装配成噬菌体颗粒,裂解宿主菌,释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。 溶源性生长(lysogenic pathway) 噬菌体感染细菌后,可将自身DNA整合到细菌的染色体中去,与之一起复制,并遗传给子代细胞,宿主细胞不被裂解 。
第三节 重组DNA基本原理 (DNA重组基本程序包括下列过程) 分—获取目的基因和载体 接—目的基因与载体的连接 转—重组DNA导入宿主细胞 筛—重组DNA的筛选与鉴定
DNA重组基本过程 1、获取
6、表达 表达产物分离纯化
一、目的基因的获取(分) 目的基因 是指所要研究或应用的基因,也是需要克隆或表达的基因。 目的基因来源 1) 制备基因组DNA 2) 制备cDNA 3) 聚合酶链反应 4) 人工合成基因
(一)制备基因组DNA(基因文库) 分离、纯化基因组DNA条件:温和,在EDTA或SDS等存在下 ↓RE用蛋白酶K消化细胞、酚抽提 大小不同酶切片段片段分离:常用蔗糖梯度或电泳分离 ↓ 分别与同样RE消化的载体连接 常用噬菌体载体或质粒载体 ↓DNA连接酶连接。 导入细胞 进入宿主细胞内培养扩增。 ↓ 筛选鉴定 用分子杂交、凝胶电泳 等方法鉴定。
(二)制备cDNA(cDNA文库) (1)合成cDNA第一条链 反应体系只有mRNA、逆转录酶、4种dNTP、引物。 引物是与mRNA3ˊ端 polyA互补的寡聚dT(12~18dT片段) (2)合成cDNA第二条链 RNase去掉模板mRNA (3)构建cDNA文库 ① cDNA两端加接头或衔接头 接头是人工合成的双链寡核苷酸两端平头,含有限制酶切位点。 衔接头是另一种人工合成的双链寡核苷酸一端平头,另一端为粘性末端。 ② cDNA与载体相连。 ③ 导入宿主细胞进行克隆,这些菌体内保存cDNA集合体便是cDNA文库。
(二)制备cDNA(cDNA文库) 分离目的基因 的mRNA 逆转录生成cDNA单链 水解去除mRNA, 合成cDNA双链 水解回折处单链 得到平端双链cDNA 导入宿主细胞克隆,构建cDNA文库
在模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶等条件下,体外经94℃变性、54℃退火及72℃延伸3个步骤的反复多次循环(2530次),扩增目的基因(见18章)。在模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶等条件下,体外经94℃变性、54℃退火及72℃延伸3个步骤的反复多次循环(2530次),扩增目的基因(见18章)。 (四)人工合成基因 引用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列,或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列,再用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。 一般先合成短片断DNA,然后再拼接成长片段。 (三)聚合酶链反应( PCR)
二、 目的基因与载体的连接(接) (主要有以下4种连接方式) 1) 粘性末端连接 2) 平头末端连接 3) 人工接头法 4) 同源多聚尾连接法