1 / 66

Лекция 14. Современные методы для изучения регуляции метаболических реакций в клетке.

Лекция 14. Современные методы для изучения регуляции метаболических реакций в клетке.

danno
Télécharger la présentation

Лекция 14. Современные методы для изучения регуляции метаболических реакций в клетке.

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Лекция 14. Современные методы для изучения регуляции метаболических реакций в клетке. Геномика и транскрипционный анализ. Проблема ИНФО. Современные возможности определения структуры и функции нуклеиновых кислот. Геномные манипуляции и технологии искусственного синтеза геномов. Матричный и безматричный синтез ДНК. Методы геномной трансплантации.

  2. I II III Секвенирование Выделение геномной ДНК и создание библиотеки фрагментов. Аннотация и анализ Сборка

  3. Достижения Фрагмент ДНК Многократная случайная фрагментация (Shotgun)

  4. Создание библиотеки www.themegallery.com

  5. Создание библиотеки Фрагмент ДНК Многократная случайная фрагментация (Shotgun) ~500 нп ~500 нп

  6. Start at primer (restriction site) Grow DNA chain Include ddNTPs Stops reaction at all possible points Separate products by length, using gel electrophoresis Sanger Method: Generating Read

  7. Automatic DNA sequencing

  8. Electrophoresis Diagrams

  9. Использованные программы Phred (http://www.phrap.org) - обработка хроматограмм LUCY (http://www.tigr.org/software/) – удаление концов вектора, оценка качества прочтений TIGR (http://www.tigr.org/software/) - сборка BAMBUS (http://www.tigr.org/software/) - взаимная ориентация контигов (построение скаффолдов)

  10. Информационные проблемы • 1 запуск до 100 гбп нуклеотидов – 10 терра байт данных – стоимость хранения до 10 тыс руб. – скорость передачи от 10-20 часов • При увеличении скорости оборудования на порядок – мы приближаемся к предельной скорости передачи данных и критической стоимости обработки информации • Обработка данных 1 запуска сиквенатора – зачастую требует до 10-20 запусков алгоритмов расчета. • Стоимость вычислительных мощностей приближается к стоимости оборудования (но реактивы отсутствуют для компьютеров)

  11. Молекулярные колонии

  12. Polonator G.007 Solexa 1G SOLiD system Системы второго поколения Genome sequencer 20/FLX www.themegallery.com

  13. Системы третьего поколениябез амплификационные (Single-molecular sequencing • Методы второго поколения, использующие ПЦР, могут выдавать ошибки, вызванные амплификацией. • SMS (Single-molecular sequencing) – новое поколение методов.

  14. 454 пиросеквенирование • Амплификация в водно-масляной эмульсии • Детекция во время синтеза – флуоресценция при отщеплении пирофосфата

  15. 454 пиросеквенирование – подготовка библиотеки Фрагментация геномной ДНК Получение тупых концов Пришивка адаптеров Получение одноцепочечной ДНК

  16. 454 пиросеквенирование – амплификация Библиотека фрагментов ДНК Иммобилизация на бусинах Приготовление водно-масляной эмульсии Получение одноцепочечной ДНК ПЦР в эмульсии

  17. 454 пиросеквенирование – считывание

  18. 454 пиросеквенирование – считывание

  19. SOLiD & Polonator • Амплификация в водно-масляной эмульсии • Детекция путём лигирования

  20. SOLiD – подготовка библиотеки

  21. SOLiD – амплификация

  22. SOLiD – считывание

  23. SOLiD – считывание Зонды Матрица Второй нуклеотид Первый нуклеотид

  24. SOLiD – считывание 1. Праймирование и лигирование Лигаза Сиквенсовый праймер Адаптер Матрица Эмиссия Возбуждение 2. Детекция 3. Кэпирование

  25. SOLiD – считывание 4. Отщепление флуоресцентной метки 5. Повторение цикла циклов 6. Денатурация и отжиг нового праймера

  26. SOLiD – считывание 7. Повторение стадий 1-5 с новым праймером 8. Повторение цикла с последовательными праймерами Позиция Праймер Праймер Праймер Праймер Вставка Праймерный цикл Праймер Вставка Праймер Вставка Цикл лигирования Тестируемые позиции

  27. Illumina SOLEXA • Амплификация на твёрдой подложке • Детекция во время синтеза – обратимые терминаторы с флуоресцентной меткой • Четыре вида флуоресцентных меток • Все нуклеотиды присутствуют одновременно

  28. Illumina SOLEXA – подготовка библиотеки Фрагменты ДНК Адаптеры

  29. Illumina SOLEXA – амплификация Адаптер Фрагмент ДНК Праймеры Адаптер Пришитые концы Свободные концы Молекулярные колонии Пришитые концы Считывание

  30. Illumina SOLEXA – считывание Первый цикл считывания Следующий цикл считывания

  31. Illumina SOLEXA

  32. HeliScope • Нет стадии амплификации – секвенирование индивидуальных молекул • Детекция во время синтеза – обратимые терминаторы с флуоресцентной меткой • Один вид флуоресцентной метки • Последовательная промывка образца нуклеотидами

  33. HeliScope Поли-А адаптер Секвенируемый фрагмент Поли-Т адаптер Подложка Детекция включения нуклеотидов

  34. HeliScope Детекция флуоресценции Промывка dNTP A G C T Подложка

  35. Новые методы секвенирования

  36. Методы нанопорового секвенирования

  37. Методы нанопорового секвенирования

  38. Методы нанопорового секвенирования

  39. Методы нанопорового секвенирования

  40. Методы нанопорового секвенирования

More Related