ELECTROFORESI

1. ELECTROFORESI David Herreros R. Biotecnologia

2. ÍNDEX • Què és la electroforesi • Tipus d’electroforesi i el seu funcionament • Protocol d’electroforesi • Bibliografia

3. QUÈ ÉS LA ELECTROFORESI La electroforesi és una tècnica analítica de separació de fonament cinètic basada en el moviment o migració de les macromol·lècules dissoltes en un determinat medi - anomenat solució tampó d'electroforesi- a través d'una matriu o suport reticulat com a resultat de l'acció d'un camp elèctric. El comportament de la mol·lècula ve donat per la seva mobilitat elctrofoètica i aquesta per la seva càrrega, mida i forma. Com major és la relació carga/mida, més ràpid migra un ió en el centre del camp elèctric Aquesta tècnica té com aventatge la seva capacitat de separar macromol·lècules d'interés en la indústria biotecnològica i química. Ha sigut un mètode molt útil per la separació de proteïnes (enzimes i hormones) i àcids nuclèics (DNA i RNA) amb gran resolució. Kit d’electroforesi

4. TIPUS D’ELECTROFORESI I FUNCIONS • Electroforesi en paper • La mostra s'aplica sobre una tira de paper de filtre humitejat amb una disolució tampó, al centre o a qualsevol dels extrems. Els extremps de la tira es submergeixen en dos recipients separats que contenen la disolució tampó i en els que es troben col·locats els electrodres. • Es connecten els electrodes a una font de tensió continua i s'aplica una diferencia de potencial durant el temps adequat. A l'aplicar un corrent directe, les mol·lècules carregades de la barreja emigren cap els electrodes de ploraitat opsada formant bandes en el paper. La velocitat d'emigració d'una mol·lèciña. deèm `referemt,emt de ña seva càrrega. Completada la electroforesi, es deconnecta la font de tensió i s'eixuguen les tires sobre una superfície neta, seca i llisa (cristall, rajola, etc.) • El revelat es realitza emprant els mateixos mètodes que els utiltizats en una cromatografia a paper, mitjançant l'acció dels colorants adients.

5. TIPUS D’ELECTROFORESI I FUNCIONS • SDS-PAGE: • És una de les més utilitzades, s'utilitza en la detecció, control de puresa, caracterització, quatificació i purificació - mitjançant la extracció de bandes des de el gel - de mol·lècules i fragments de DNA i ARN. • Els gels més utilitzats son els tridimensionals de polímers ramificats que tenen els espais entre ramificació farcits de líquid. Les xarxes de polímers no només reprimeixen la convencció sino que també actua com a seleccionadors que poden endarrerir i fins i tot bloquejar la migració dels analits polimèrics més grans. En canvi els ions petits poden moures lliurement a través de l'estructura porosa del gel. D'aquesta manera la electroforesi en gel disposa de dos mecanismes de separació: la que separa per relació càrrega/mida i la que separa per tamisació. • Els gels més comunment emprats són l’agarosa i la poliacrilamida. Preparació del gel per una electroforesi en placa http://www.youtube.com/watch?v=IWZN_G_pC8U Exemple de resultats d’una electroforesi

6. TIPUS D’ELECTROFORESI I FUNCIONS • Isolectroenfocament • També anomenada electroenfocament, es basa en el desplaçament de les mol·lèculse en una gradiant de pH. Les mol·lècules amfotèriques, com els aminoàcids, es separen en un medi en el que existeix una diferencia de potencial i una gradiant de pH. La regió de l'ànode (+) és àcida i la del càtode (-) és alcalina. Les substàncies que es troben inicialment en regions de pH inferior al seu punt isoelèctric estaran carregades positivament i migraran cap el càtode, i a la inversa. D'aquesta forma les mol·lecules amfotèriques es situaran en estretes bandes on coincideixen amb el seu punt isoelèctric i el seu pH. Electroforesi 2D de múscul esquelètic d’una rata. Font: UPF 2009 Representació gràfica electroforesi per electroenfocament.

7. TIPUS D’ELECTROFORESI I FUNCIONS • Inmunoelectroforesi: És una convinació d'una electroforesi en gel d'agarosa seguida d'una inmunodifusió. En la primera part es realitza una aplicació puntual de la mostra. Acabada la electroforesi, i sense fer la tinció, es practica en el gel un canal paral·lel a la direcció de migració amb un bisturi de doble fulla en el que es diposita un antiserem que contingui anticosos específics en front a una o diverses proteïnes separades a la electroforesi. Els gels es mantenten a temperatura ambient durant 24-48h. ELs anticosos i proteïnes - que actuen com antígens -, produeixen complexos antígen-anticos insolubles que precipiten i apareixen en el gel com a bandes elipsoidals. Cada proteïna de la mostra produeix una banda de precipitació independent pel que és possible identificar el número de constituients de la mostra que son reconeguts pels anticosos. Esquema Inmunoeltroforesi http://www.youtube.com/watch?v=EAofAmrMQtk

8. TIPUS D’ELECTROFORESI I FUNCIONS • Electroforesi capil·lar: • La electroforesi en gel en les seves diverses formes resulta un mètode efectiu, però el procés per la separació de mol·lècules pot durar diverses hores, essent difícil de quantificar i automatitzar. • La tècnica que es duu a terme a l'interior de tubs capil·lars (1–10 μm de diàmetre), disipen el calor ràpidament permetent l'aplicació de camps elèctrics elevats, reduint els temps de separació Sistema d’electroforesi capil·lar

9. PROTOCOL ELECTROFORESI SOBRE PAPER Equipament: - Sistema d'electroforesi - Fotodensímetre Material: - Pipetes de 1-5 ml - Micropipetes de 25-1000 μl. - Puntes de rebuig - Vasos de precipitat - Tires de paper especial de filtre o de acetat de celulosa impregnats en la solució amortiguadora correponent Reactius: - Aigua destil·lada - Solucions amortiguadores - Colorants - Decolorants

10. PROTOCOL ELECTROFORESI SOBRE PAPER • Protocol a seguir: • S'adapta a la càmera d'electroforesi les tires impregnades amb la solució amortifuadora • 2) S'aplica la mostra. Es disposita de 10-15 μl en una fina banda a la zona del càtode paral·lela als pols de la cubeta electroforètica, per separar proteïnes del sèrum o de qualsevol líquid biològic • 3) Es separen les diferents fraccions mitjançant el pas del corrent. La durada depen de la intensitat i el voltatge subministrat. S'apliquen 0,26 mA per cm d'amplada de la tira • 4) Acabada la separació, la tira es treu i s'eixuga a l'estufa entre 60-110ºC • 5) S'acoloreix submergint la tira en la solució colorant durant 5 min. El temps de coloració varia segons el colorant emprat, oscilant entre 5-30min • 6) Es renta 3 cops amb una solució d'àcid acètic al 5% • 7) S'eixuga a temperatura ambient. • 8) Es decolara, retiran l'excés de colorant. Es deixa només el que ha sigut fixat per les proteïnes.

11. REFERÈNCIES BIBLIOGRÀFIQUES En format web: • http://oldearth.wordpress.com/2008/10/16/experimentos-de-biologia-molecular-1-electroforesis • http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-Electroforesis-protocolos.pdf • http://www.monografias.com/trabajos13/sepal/sepal.shtml • http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/page.htm#Tipos de electroforesis • http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-ol/pdfs/15%20ELECTROFORESIS.pdf • http://www.upf.edu/sct/es/proteomica/presentacio/ef2d.html • http://www.youtube.com/watch?v=EAofAmrMQtk • http://www.youtube.com/watch?v=IWZN_G_pC8U

12. FI – בסוף Institut escola del treball 2010