1 / 52

Mikroorganismu gēnu inženierija

Mikroorganismu gēnu inženierija. 1 5 . lekcija. Vīrusu vektori. Lambda fāga vektori. Bakteriofāgs l ir viens no vislabāk izpētīt ajiem vīrusiem . Ir zināma tā genoma nukleotīdu secība kā arī katra tā gēna funkcija un regulācija s mehanismi. Lambda fāga vīrusa daļiņas

diata
Télécharger la présentation

Mikroorganismu gēnu inženierija

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Mikroorganismu gēnu inženierija 15. lekcija Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  2. Vīrusuvektori Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  3. Lambda fāga vektori Bakteriofāgs l ir viens no vislabāk izpētītajiem vīrusiem. Ir zināma tā genoma nukleotīdu secība kā arī katra tā gēna funkcija un regulācijas mehanismi. Lambda fāga vīrusa daļiņas satur lineāru divpavediena DNS (48 514 bp), bet šūnā fāgs sastopams cirkulārā formā, pateicoties 12 nt gariem komplementāriem cos saitiem molekulas abos galos. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  4. Lambda fāgs Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  5. Lambda fāgs Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  6. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  7. Lambda fāga vektori l fāga dzīves cikls pēc šūnas infekcijas var attīstīties pa lītisko vai lizogēno ceļu. Lītiskajā attīstības ceļā notiek promoteru PL un PR aktivācija, kā rezultātā notiek DNS replikāciju kontrolējošo gēnu produktu O un Q sintēze, kā arī šūnas līzes proteīnu sintēze. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  8. Lambda fāga vektori Lizogēnais attīstības cikls atkarīgs no cII ekspresijas. Seko: PE aktivācijas, kā rezultātā tiek stimulēta l represora cI ekspresija, PI aktivācija, kā rezultātā notiek int gēna ekspresija un fāga integrācija baktērijas hromosomas attsaitā. Lizogēno stāvokli uztur represors cI Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  9. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  10. Lambda fāga vektori Lineārajā formā l fāga genoma kreisjā galā atrodas apvalka proteīnu gēni (galvas un astes proteīni), labajā galā izvietoti ar DNS sintēzi un lītisko ciklu saistīti gēni, bet vidū ar lizogēno dzīves ciklu saistīti gēni. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  11. labais plecs kreisais plecs Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  12. Lambda fāga vektori l fāga gēni, kas atbildīgi par lizogēno attīstības ciklu nav nepieciešami fāga dzīvotspējai un tos var aizvietot ar svešu, 12 - 20 kb garu DNS posmu. l fāga pakošanai fāga kapsīdā nepieciešams, lai rekombinantais vīrusa genoma lielums iekļautos robežās 80% - 110% no savvaļas tipa l fāga genoma. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  13. Lambda fāga vektori Ja rekombinantā fāga DNS sanāk pārāk īsa, to nav iespējams veiksmīgi iepakot kapsīdos. Līdzīgi - arī pārāk garšs vīrusa DNS nesatilpst regulārās formas kapsīdā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  14. Lambda fāga vektori Aizvietojot lizogēnā cikla gēnus ar svešu DNS un in vitro pakojot to vīrusa kapsīdā, iespējams iegūt normālas vīrusa daļiņas, no kurām 5-10% būs infekciozas. Tas atbilst transdukcijas efektivitātei 1 - 2 x 109 uz mg DNS, kamēr transformējot plazmīdu DNS, šūnā nonāk tikai 0,0005-0,05% plazmīdu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  15. Lambda fāga vektori Klonēšana l fāga genomā: 1. Vektora DNS šķelšana ar atbilstošu restriktāzi, kreisās un labā pleca atdalīšana; 2. Ligēšanas reakcija insertējamās DNS un abu fāga DNS plecu klātbūtnē; 3. Iegūtās rekombinantās DNS in vitro pakošana kapsīdos un transdukcija; 4. Rekombinanto klonu identifikācija, piemēram, izmantojot nukleīnskābju hibridizāciju. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  16. COS Kreisais plecs COS Kreisais plecs COS Kreisais plecs + Inserts Inserts Inserts Inserts COS COS Labais plecs COS Lambda fāga vektori Restrikcijas šķelšana Restrikcijas šķelšana Nebūtisks DNS rajons Labais plecs COS Nebūtisks DNS rajons Labais plecs COS COS Kreisais plecs COS Kreisais plecs Iepakošanai gatavs genoms Iepakošanai gatavs genoms Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  17. Lambda fāga vektori Izšķir l fāga vektorus: • insercijas vektori - tajos var klonēt līdz 12 kbp un tie ir piemēroti cDNS bibliotēku veidošanai. Piemēram, lambda ZAP II, ZAP Express (insertu ekspresijai) • aizvietošanas vektori - tajos var klonēt 9 - 23 kbp un tie ir piemēroti genomisko DNS bibliotēku veidošanai, piemēram, lambda EMBL4, Charon 4A Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  18. Lambda fāga insercijas vektori Lambda ZAP II un lambda ZAP Express. Lai gan tajos var klonēt tikai līdz ~10 kbp DNS, vektori ir piemēroti - kDNS klonēšanai; - ātram rekombinanto klonu skrīningam, izmantojot nukleīnskābju hibridizāciju vai arī ekspresēto proteīnu imūnreakcijas ar specifiskām antivielām. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  19. l ZAP II Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  20. l ZAP Express Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  21. Lambda fāga aizvietošanas vektori Klasiskie l fāga aizvietošanas vektori. Piemēram, Charon 4A genoma lizogēnā cikla rajoni aizvietoti ar neitrālas DNS fragmentu, kuru pirms klonēšanas aizvāc. Klonēšanu parasti veica EcoRI saitā. Pašligētie fāga DNS “pleci” ir pārāk īsi, lai tie varētu iepakoties fāga kapsīdā. Tādēļ visas infekciozās fāga daļiņas satur 10 - 20 kbp garu insertu. Trūkums: Neērti novietoti restrikcijas saiti un to ir maz. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  22. Lambda fāga vektori Modernie l fāga aizvietošanas vektori Piemēram, lambda FIX un lambda DASH (Stratagene). Satur vairākus ērti izvietotus restriktāžu saitus, kam netālu atrodas T3 un/vai T7 RNS polimerāzes promoteri, kas atļauj sintezēt insertētā fragmenta galiem komplementāras zondes. Īpaši piemēroti vidēja izmēra insertus saturošu genomisko DNS bibliotēku veidošanai. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  23. l FIX Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  24. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  25. M 13 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  26. M13 bakteriofāgs Vienpavediena cirkulāru DNS (+ pavediens) saturošs E. colivīruss. 6 400 nt. Genomā atrodas 10 gēni (I-X) Inficē E. coli šūnas, kurām ir F-pili (satur F plazmīdu). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  27. M13 nelizē šūnas, tomēr aizkavē to augšanu un tādēļ veido plakus. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  28. M13 bakteriofāgs • Kapsīdu veido pVIII proteīns (ap 2 700 molekulas); • pIII un pVI nodrošina saistīšanos pie F-piliem ( 5-8 kopijas); • pVII un pIX nodrošina jaunu fāga daļiņu izkļūšanu no šūnas Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  29. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  30. M13 bakteriofāgs M13 replikācija: Iekļūstot baktērijā, uz fāga (+) DNS matrices tiek uzsintezēts otrais (-) DNS pavediens - izveidojas fāga replikatīvā forma(RF). Vīrusa genoma vienā vietā atrodas palindromiski atkārtojumi, kuri izveido "matadatas" (hairpin) struktūru. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  31. M13 bakteriofāgs M13 replikācija: Šo struktūru atpazīst E. coli RNS polimerāze un izveido RNS oligomēru, kurš kalpo par praimeri (-) DNS pavediena sintēzei. Sintēzi veic E. coli DNS polimerāzeIII. DNS (-) pavediens kalpo par matricijaunu (+) DNS pavedienu sintēzei. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  32. M13 bakteriofāgs M13 replikācija: (+) pavediena replikācija notiek pēc ripojošā apļa principa. IS rajonā (+) pavedienā gp2 nukleāze (gēna II produkts) izdara DNS pārrāvumu, kas kalpo par praimeri jaunā (+) pavediena sintēzei. Vecā (+) pavediena 3' gals tiek pagarināts sintezējot (-) pavediena kopiju, bet vecā (+) pavediena 5' gals tiek attālināts no (-) DNS matrices. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  33. M13 bakteriofāgs M13 replikācija: Kad jaunā (+) pavediena sintēze veikusi visu apli, gp2 nukleāze atdala veco (+) pavediena kopiju, kura tiek cirkularizēta veidojt jaunu (+) vpDNS vīrusa genoma kopiju. Uz tās atkal var tikt sintezēts (-) pavediens, vairojot vīrusa RF DNS. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  34. M13 bakteriofāgs M13 replikācija: 2. etaps. Vēlīnā infekcijas stadija, kad šūnā uzkrājies daudz pV proteīna (vienpavediena DNS saistītājproteīns), vairums jaunsintezēto (+) pavedienu saistās ar pV proteīnu un vairs nekalpo par matrici (-) pavediena sintēzei. Veidojas virionam līdzīgi nukleoproteīnu kompleksi. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  35. M13 bakteriofāgs M13 replikācija: 3. etaps. Notiek RF molekulu skaita samazināšanās un jaunu fāga daļiņu veidošanās. Vienpavediena (+) DNS izkļūst caur šūnas membrānai ar IS rajonu pa priekšu. Šajā laikā notiek DNS inkapsidācija, jo kapsīdu proteīni jau atrodas šūnas membrānas sastāvā. Katrā šūnā veidojas apmēram 200 fāga kopijas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  36. M13 bakteriofāgs Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  37. Fāga M13 vektori Visi M13 gēni nepieciešami tā dzīves cikla realizācijai. Vienīgā genoma vieta, kurā var ievadīt svešu DNS ir IS rajons, kurš atbildīgs par fāga replikāciju. Tie paši cilvēki, kas izveidoja pUC vektorus, izveidoja arī populāru M13 vektoru sēriju. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  38. Fāga M13 vektori Šie M13 vektori satur to pašu lacZ gēna fragmentu, promoteru un MCS, ko atbilstošās pUC plazmīdas (M13mp19 vektors atbilst pUC19 plazmīdai). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  39. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  40. Fāga M13 vektori Pateicoties visai brīvam fāga DNS iepakošanas veidam, inserta izmēri var 6-7 x pārsniegt paša fāga DNS izmērus. M13 fāgā ir izdevies ievadīt 42 kb garus insertus. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  41. Fāga M13 vektori M13 vektoru priekšrocības: • M13 vektori atļauj tiešo zili/balto selekciju - insertu nesaturoši vektori sintezē LacZ a polipeptīdu un plaki krāsojas zili; • M13 vektoriem nav striktu inserta izmēru ierobežojuma - fāga kapsīdu veidojošie proteīni spēj ietver plašu DNS izmēru spektru; • M13 vektoru izmantošana atļauj iegūt inserta DNS vienpavediena DNS veidā, kuru var izmantot DNS sekvenēšanai, hibridizācijas zondēm un saitspecifiskai mutaģenēzei. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  42. Fāga M13 vektori M13 vektoru priekšrocības: • M13 replikatīvo formu, ar kuru veic DNS manipulācijas, ir iespējams ievadīt saimniekšūnā ar augstu efektivitāti. M13 vektoru trūkumi: • M13 vektori, kas satur insertus nav stabili un tajos ir novērojamas delēcijas un rekombinācijas. Īpaši nestabili ir lielus insertus saturoši vektori; • Insertus nesaturošiem fāgiem ir selektīvas priekšrocības un fāgiem vairojoties tie dominē populācijā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  43. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  44. Fagmīdu vektori Dažreiz GI eksperimentos nepieciešama vienpavediena DNS: - nukleīnskābju hibridizācijai; - mutaģenēzei - (DNS sekvenēšanai). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  45. Fagmīdu vektori Plazmīdu sastāvā klonētā DNS ir divpavedienu formā. Vienpavediena DNS var iegūt pārklonējot interesējošo gēnu vienpavediena DNS vektoros, piemēram, fāgā M13 vektoros. Bet pārklonēšana apgrūtina eksperimetus. Darbs ar vīrusiem ir sarežģītāks, darbietilpīgāks. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  46. Fagmīdu vektori Vienā plazmīdā ir iespējams apvienot gan plazmīdas replikācijas ORI, gan vienpavediena DNS fāga replikācijas ORI, izveidojot plazmīdas un fāga hibrīdu - fagmīdu (phagemid , phasmid). Iesākumā par fagmīdām apzīmēja no vienpavediena DNS baktēriju vīrusiem atvasinātus vektorus, kuri var pastāvēt arī plazmīdas formā. Tagad nereti šo nosaukumu attiecina uz visiem vektoriem ar kombinētām vīrusa un plazmīdas iezīmēm. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  47. Fagmīdu vektori Fagmīdas saimniekšūnā replicējas izmantojot plazmīdas replikācijas ORI un tiek uzturētas divpavedienu DNS formā. Fāga replikācijas kontroles rajons (ORI) netiek izmantots, jo normāli saimniekšūnā nav nepieciešamo proteīnu faktoru. Lai fagmīdas replicētos pēc fāga vairošanās mehānisma, nepieciešams helperfāgs (helper phage). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  48. Fagmīdu vektori Lai ierosinātu fāga formas replikāciju, saimniekšūnas inficē ar helperfāgu. Helperfāgs šūnā sintezē proteīnus, kas nepieciešami fāga (un arī fagmīdas) replikācijai pēc ripojošā apļa principa, kā arī fāga kapsīda proteīnus. Vienpavediena fagmīdas DNS un arī helperfāga DNS tiek iepakota fāga kapsīdā un izkļūst ārā no šūnas. Fāgu daļiņas savāc un no tām izdala vienpavediena DNS. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  49. Fagmīdu vektori Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  50. Fagmīdu vektori • pBS grupas fagmīdas ir izveidotas no pUC plazmīdām un satur: • ApR gēnu; • ColEI replikācijas ori; • MCS; • lacZa polipeptīda gēnu; • fāga f1 replikācijas ORI 2 orientācijās Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

More Related