Torque teno vírus (TTV)

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SULFACULDADE DE VETERINÁRIAPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Torque teno vírus (TTV) (Exame de qualificação) Thais Fumaco Teixeira

2. Histórico • 1997: Torque teno vírus (TTV) • Paciente com hepatite pós-transfusional de etiologia desconhecida • Iniciais do nome do paciente (T.T.) • “transfusion transmitted virus”

3. Histórico • 2000: “TTV-like mini virus” (TLMV) • 2005: Novo significado para TTV e TLMV • Torque teno vírus (TTV) • Torque teno mini vírus (TTMV) • “Torque” = colar • “teno” = pequeno

4. Histórico • 2007: Torque teno midi-vírus (TTMDV) • Vírus relacionado ao TTV • Tamanho intermediário

5. Histórico • Infecção por TTV não é restrita a humanos • Chimpanzés • Tupaias • Suínos • Bovinos • Cães • Gatos • Leões marinhos

6. Taxonomia • Família Anelloviridae • Gênero Anellovirus • Sub-classificados em genogrupos

7. Taxonomia

8. Características moleculares • DNA circular • Fita simples • Polaridade negativa • Variabilidade no tamanho • TTV humano (3,4 kb – 3,9 kb) • TTMDV (3,2 kb) • TTMV (2,8 kb – 2,9 kb) • TTSuV (2,9 kb) • TTV felino (2,1 kb)

9. Epidemiologia • Amplamente difundidos • Distribuição não está associada com a sua origem geográfica • Prevalência TTSuV1 varia de 24% a 100% • Prevalência de TTSuV2 na Espanha (77%)

10. Epidemiologia • TTV estaria associado a diferentes patologias auto-imunes: • Doenças reumáticas • Patologias hepáticas • Disturbios respiratórios • Não existem dados definitivos indicando que TTV é responsável por qualquer doença em humanos • Vírus órfão

11. Epidemiologia • Em suínos: TTSuV infecta uma elevada proporção de animais aparentemente saudáveis • Co-infecção com outros patógenos • Prevalência de TTSuV2 em suínos com SMDS (91%) e em suínos saudáveis (72%) (Kekarainenet al., 2006) • TTSuV1 facilita indução da SMDS pelo PCV2 (Ellis et al., 2008)

12. Patogenia • DNA de TTV tem sido identificado em: • Células mononucleares de sangue periférico; • Células hematopoiéticas da medula óssea; • Plasma; • Fezes; • Saliva; • Suabes nasais e de garganta. • Aparentemente necessita de células em multiplicação ativa para se replicar

13. Transmissão • Principal transmissão TTSuV: oral-fecal (soro, plasma, fezes) • Transmissão vertical: colostro, útero, soro de porcas e seus natimortos • Sêmen • Trato respiratório: pulmões, secreções nasais e saliva

14. Detecção de Torque teno vírus suíno 1 (TTSuV1) em diferentes tecidos de suínos

15. Introdução • Aparentemente TTSuV não tem associação com qualquer patologia • Estudo mostrou uma aparente associação negativa entre a presença de TTSuV1 e a ocorrência da SMDS (Teixeira et al., 2008) • Estudo de distribuição de TTSuV em tecidos detectou uma maior prevalência de TTSuV no pulmão (Bigarré et al., 2005)

16. Introdução • Replicação do TTSuV não parece estar restrita a este órgão • Formas replicativas intermediárias de fita dupla de TTV foram encontradas: • Fígado • Células da medula óssea • Pulmão • Pâncreas • Baço • Outros tecidos linfóides

17. Objetivos • Detecção de TTSuV em órgãos de suínos com e sem a Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos;

18. Material e Métodos • Amostras • Órgãos de suínos (pulmão, fígado, rim, baço e linfonodo) • 11 suínos saudáveis • 76 suínos com SMDS • Extração de DNA • Quantificação (100 ng) • PCR

19. Material e Métodos • Sensibilidade da PCR • Produto da PCR de TTSuV1 (349 pb) e TTSuV2 (572 pb) clonado no vetor pCR2.1; • Sequenciamento; • Plasmídeo: C+1 e C+2; • DNA plasmidial foi quantificado; • Diluição seriada na base 10.

20. Material e Métodos • Construção do controle interno • Mesmos primers usados na PCR para TTSuV1 e 2; • PCR com temperatura de anelamento de 40 °C; • TTSuV1: célula de linhagem de rim de suíno (SK6); • Produto de 293 pb foi clonado e sequenciado; • Plasmídeo: CI1; • TTSuV2: célula de linhagem de rim de suíno livre de PCV1 (PKsC3); • Produto de 441 pb foi clonado e sequenciado; • Plasmídeo: CI2; • DNA plasmidial foi quantificado; • Diluição seriada na base 10.

21. 2 3 4 5 6 7 1 349 bp 400 bp 293 bp 200 bp 2 3 4 5 6 7 1 572 bp 500 bp 441 bp Resultados A) B) Figura1. A) Sensibilidade da PCR para detecção de TTSuV1 B) Sensibilidade da PCR para detecção de TTSuV2

22. Resultados Tabela 1. Prevalência de TTSuV1 e 2 em tecidos de suínos saudáveis e com Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS). Com um tecido positivo o animal foi considerado positivo para TTSuV. % de suínos positivos para sTTV1 % de suínos positivos para sTTV2 100 (11/11) 48.7 (37 /76) 55.17 (48/87) 100 (11/11) 94.7 (72 /76) 93.1 (81/87) Suínos saudáveis (n=11) Suínos com SMDS (n=76) Total (n=87)

23. Resultados Tabela 2. Prevalência de TTSuV1 e 2 em 5 diferentes amostras de tecidos de suínos saudáveis e com a Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS). Órgãos Grupos Pulmão Fígado Rim Baço Linfonodo TTSuV1 TTSuV2 Suínos saudáveis 100% (11/11) 100% (11/11) 90.9% (10/11) 100% (11/11) 100% (11/11) 81.8% (9/11) 81.8% (9/11) 90.9% (10/11) 100% (11/11) 81.8% (9/11) Suínos com SMDS TTSuV1 TTSuV2 37.7% (26/69) 41.9% (31/74) 37.8% (28/74) 38.5% (27/70) 30.4% (21/69) 68.1% (47/69) 76.8% (53/69) 59.4% (44/74) 77.1% (54/70) 81.1% (60/74)

24. Resultados Figura 2. árvore filogenética baseada na sequência de nucleotídeos da região não traduzida do genoma do TTSuV. Número de acesso do GenBank das sequências de referência para TTSuV1 (AB076001 e AY823990) e TTSuV2 (AY823991).

25. Discussão • Bigarré et al. (2005) relatou que o TTSuV foi encontrado mais frequentemente no pulmão. (11,2% pulmão; 8,1% linfonodo inguinal; 5,6% linfonodo mesentérico; 4,4% tonsila; 3,1% ileo) • Difere dos resultados encontrados por Ellis et al. (2008) e Kekarainen et al.(2006).

26. Conclusão • Trabalho mostra que a distribuição de TTSuV1 em tecidos aparentemente não apresenta em particular um órgão alvo. • Resultados reforçam uma aparente correlação inversa entre a presença de TTSuV1 e o desenvolvimento da SMDS. • Corrobora com trabalho prévio realizado por nossa equipe.

27. Torque teno vírus suíno (TTSuV) em cultivos celulares e tripsina

28. Introdução • Interação entre TTSuV e PCV2 • Sistema eficaz de replicação para o TTSuV • Nenhum cultivo que permita a propagação de TTSuV foi identificado • Nenhum cultivo foi avaliado em busca de TTSuV como contaminante

29. Objetivos • Detectar a presença de genomas de TTSuV em células de linhagem, soro e tripsina

30. Material e Métodos • Amostras • 25 células de linhagem • 10 células em cultivo • 15 ampoladas e estocadas em nitrogênio líquido • 9 lotes de soros (diferentes fornecedores) • Soro fetal bovino • Soro de equíno • Soro de ovino • Soro de terneiro • 5 lotes de tripsina

31. Material e Métodos • Extração de DNA • Quantificação (100 ng) • PCR • forward-1: 5’ GGG AGC TCA AGT CCT CAT TTG 3’ • forward-2: 5’ GGG CCW GAA GTC CTC ATT AG 3’ • reverso: 5’ GCG GCA TAA ACT CAG CCA TTC 3’ (Rijsewijk,2008) • TTSuV1: 106 pb • TTSuV2: 103 pb

32. Material e Métodos • Todos os produtos de PCR foram clonados e sequenciados • Sequências obtidas foram depositadas no GenBank n° de acesso (GU574709 A GU574729) • Análise filogenética

33. Resultados

34. Resultados

35. Resultados

36. Resultados Fig. 1. Árvore filogenética baseada nas sequências de nucleotídeos da região não codificante do genoma dos sTTVs. AB076001 e AY823990 são as sequências de referência para sTTV1 e AY823991 é a sequência referência para sTTV2.

37. Discussão • Devido a natureza ubíqua do TTSuV fontes comuns de transmissão devem existir (McKeown et al., 2004) • Vacinas preparadas em células contaminadas • Kekarainen et al. (2009) relataram presença de TTSuV1 e 2 em enzimas e vacinas. • Segales et al. (2009) também detectaram TTSuV1 e 2 em soro de suínos desde 1985.

38. Conclusão • Primeira evidência de TTSuV como contaminante celular. • Resultados sugerem que a fonte da contaminação pode ter sido a tripsina. • Contaminação existente no laboratório desde 1985 (Tireóide bovina-TB).

39. Obrigada ! Thais Fumaco Teixeira Doutoranda PPGCV