Diagnóstico por componentes en alergia alimentaria

1. Pamplona 7-8 Mayo 2010 Diagnóstico por componentes en alergia alimentaria María Luisa Sanz Departamento de Alergología e Inmunología Clínica

2. Diagnóstico de precisión en Alergia alimentaria -Verificar los Ac IgE específicos funcionalmente relevantes Distinción: Sensibilización-Alergia Problemas reactividad cruzada: Pólen-alimento Alimento-alimento:PP!! -Identificación de las moléculas o epítopes responsables

3. Herramientas que han abierto nuevos horizontes en el diagnóstico de alergia alimentaria Pasado y presente del diagnóstico alergológico Harwanegg C. et al CEA 2003

4. Pru p 1 Pru p 3 Pru p 4 Diagnóstico basado en componentes permite Identificar los patrones individuales de sensibilización frente a: -Diferentes proteínas de una única fuente alergénica -Proteínas homólogas en diferentes alimentos -Diferentes epítopes de una molécula alergénica

5. Patrones diferentes de sensibilización según área geográfica Component-resolved diagnosis (CRD) Norte de Europa Pru p 1 Pru p 4 SAO Pru p 1 Pru p 3 Pru p 4 Europa mediterránea Pru p 3 Síntomas sistémicos Fernández-Rivas M et al. J Allergy Clin Immunol. 2003 Oct;112(4):789-95. Gamboa PM et al Allergy 2008 Asociación riesgo: LTP Asero 2000

6. PR-10 Diagnóstico basado en componentes permite Identificar los patrones individuales de sensibilización frente a: -Diferentes proteínas de una única fuente alergénica -Proteínas homólogas en diferentes alimentos -Diferentes epítopes de una molécula alergénica

7. Reactividad cruzada

8. Tropomiosina Albúmina sérica Quitinasas de clase I Profilinas, Proteínas alto peso molecular PR-10 (homólogos de bet v 1) Profilinas Vicilina Sindromes de reactividad cruzada y componentes alergénicos Ácaros/Gamba/Caracol/Cucaracha Cerdo-gato Látex-frutas Artemisia-apio-zanahoria- especias Polen de abedul-alimentos (manzana, zanahoria, avellana, apio, patata) Gramíneas-melocotón Cacahuete-guisante

9. Diagnóstico basado en componentes permite Identificar los patrones individuales de sensibilización frente a: -Diferentes proteínas de una única fuente alergénica -Proteínas homólogas en diferentes alimentos -Diferentes epítopes de una molécula alergénica Persistencia Gravedad...

10. Epitopos IgE en los alergenos alimentarios SPOT μArrays μArrays-TAB J.Lin, H.Sampson. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2009

11. Familias principales de alérgenos 143 familias de alérgenos que contienen 889 alérgenos http://www.meduniwien.ac.at/allergens/allfam/

12. Familias mas importantes de alérgenos alimentarios vegetales N=8 Karin Hoffmann-Sommergruber & E. N. Clare Mills Anal Bioanal Chem (2009) 395:25–35

13. Familias mas importantes de alérgenos alimentarios animales N=8 Karin Hoffmann-Sommergruber & E. N. Clare Mills Anal Bioanal Chem (2009) 395:25–35

14. Alérgenos moleculares o componentes alergénicos Bases de datos www.allergen.orgweb internacional de nomenclatura de alérgenos (IUIS-WHO) www.allergome.org web sencilla, completa y con numerosos links www.ifr,ac.uk/protall base de datos de Ag alimentos. Proyecto UE

15. PR-10 Panalérgeno -Proteínas homólogas -Molécula compartida por diferentes fuentes alergénicas separadas filogenéticamente, con estructura y función similar que explican fenómenos de reactividad cruzada Bétula, manzana, cataña... Homólogo de Bet v1

16. Panalérgeno -Proteínas homólogas -Molécula compartida por diferentes fuentes alergénicas separadas filogenéticamente, con estructura y función similar que explican fenómenos de reactividad cruzada Tropomiosina

17. Panalérgenos

18. Allergome Sequence Homology ring Moléculas relacionadas con Pru p 3

19. Allergome Sequence Homology ring Moléculas relacionadas con Der p 10

20. ¿Que es un microarray? • Los microarrays son matrices bidimensionales de alta densidad donde se ha inmovilizado material biológico que permite la automatización simultánea de miles de ensayos en paralelo. • El material inmovilizado, que se utiliza como sonda biológica, pueden ser ácidos nucleicos (Oligonucleótidos o cDNA), proteínas, (anticuerpos, enzimas, etc.), pequeñas moléculas, etc.

22. Primeros estudios de Microarrays aplicados a alergia con extractos alergénicos completos • Detection of Multiple Allergen-specific IgEs on Microarrays by Immunoassay with Rolling Circle Amplification • Steve Wiltshire, Shawn O’Malley, Jeremy Lambert, Kari Kukanskis, David Edgar, Stephen F. Kingsmore and Barry Schweitzer • Clin Chem 2000

23. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology 2002 Microarrayed allergen molecules: diagnostic gatekeepers for allergy treatment Reinhard Hiller, Sylvia Laffer, Christian Harwanegg, Martin Huber, Wolfgang M. Schmidt, Anna Twardosz, Bianca Barletta, Wolf M. Becker, Kurt Blaser, Heimo Breiteneder, Martin Chapman, Reto Crameri, Michael Duchêne, Fatima Ferreira, Helmut Fiebig, Karin Hoffmann-Sommergruber, Te Piao King, Tamara Kleber-Janke, Viswanath P. Kurup, Samuel B. Lehrer, Jonas Lidholm, Ulrich Müller, Carlo Pini, Gerald Reese, Otto Scheiner, Annika Scheynius, Horng-Der Shen, Susanne Spitzauer, Roland Suck, Ines Swoboda, Wayne Thomas, Raffaela Tinghino, Marianne Van Hage-Hamsten, Tuomas Virtanen, Dietrich Kraft, Manfred W. Müller, and Rudolf Valenta Presentan la nueva tecnología de microarrays para el diagnóstico en alergia tipo I Utilizan proteínas naturales purificadas o recombinantes procedentes de 35 diferentes fuentes alergénicas, que las fijan a portas preactivados mediante técnica de microarrays La mayor diferencia con otras tecnologías convencionales es que el microarray contiene las moléculas definidas de cada alérgeno como reactantes. Permite la identificación de las moléculas responsables

24. CEA 2007 VENTAJAS Miniaturización del diagnóstico alergológico Va a hacer realidad el sueño de conocer todas las especificidades de la IgE en un paciente alérgico

25. Diagnóstico molecular de la hipersensibilidad mediada por IgE Diagnóstico basado en componentesMicroarray

26. 7,5 cm 2,5 cm Microarray de IgE específica Determinación semi-cuantitativa la IgE específica frente a 103 componentes alergénicos, recombinantes y naturales purificados, mediante la tecnología MICROARRAY ISAC 103 ( Phadia, Suecia).

27. Microarrays de proteínas para la determinación de IgE específica Matriz de componentes alergénicos en la determinación de sIgE ISU

28. MICROARRAY ISAC 103 (Immuno solid phase chip) Determinación semi-cuantitativa de la expresión de IgE específica frente a 103 proteínas purificadas y recombinantes Obtención suero Incubación muestra Revelado.Se añade espAc Wash <50 ml suero Duración: 3 hours Escanea el biochip Análisis de imagen Obtención Informe Lavado Duración: 10 min.

29. PANEL DE ALERGENOS DEL MICROARRAY ISAC 103 (Immuno solid phase chip) ISAC CDR 103

30. ISAC CRD 103 Proteínas de almacenaje - Proteínas procedentes de las semillas sirviendo como materia prima durante el crecimiento de la planta. -A menudo prot estables y resistentes al calor causando reacciones en alimentos cocinados Alérgenos de origen vegetal -Marcadores especie específicos -Marcadores de reactividad cruzada

31. ISAC CRD 103 Proteínas PR-10 Homologos Bet v 1 • En el Norte y Centro de Europa el abedul o los pólenes relacionados son considerados los sensibilizadores más importantes causantes de síntomas respiratorios. -La presencia de proteínas PR10 en vegetales y frutas puede causar síntomas debido a reactividad cruzada con dichos pólenes. -Se puede asociar a SAO Omega 5 gliadina Asociada a anafilaxia inducida por ejercicio Alérgenos de origen vegetal

32. ISAC CRD 103 Alérgenos de origen vegetal LTP • Proteínas termoestables a proteasas digestivas, causantes de reacciones en alimentos cocinados asociadas a reacciones sistémicas graves

33. Alérgenos de origen vegetal -Marcadores de reactividad cruzada Panalérgeno que muestra una gran homología y reactividad cruzada entre profilinas de diversas especies vegetales, incluso entre aquellas alejadas filogenéticamente. En algunos casos asociados a SAO en síndromes a polen-frutas.

34. Alérgenos de origen vegetal -Marcadores de reactividad cruzada Marcador de sensibilización de reactividad cruzada por determinantes carbohidratos. Raramente asociado con síntomas clínicos pero posible causa de reacciones en algunos pacientes

35. Alérgenos no vegetales -Marcadores especie específicos Anisakis Ani s 1

36. Marcadores de reactividad cruzada Ag mayoritario del pescado y panalérgeno de este grupo. Marcador de reactividad cruzada entre especies de pescados y anfibios. Proteína estable al calor y a la digestión, causando reacciones con alimentos cocinados Proteína fijadora de actina localizada en las fibras musculares. Marcador de reactividad cruzada entre artrópodos (crustáceos, arácnidos e insectos)

37. Estudios de validación de la técnica de microarrays en alergia alimentaria

38. Allergy 2008 N=130 niños con sospecha de alergia alimentaria mediada por IgE En todos ellos Prueba de Provocación con leche de vaca y/o huevo

39. Prueba cutánea IgE esp (CAP) Microarrays (ISAC CRD 51, VBC Genomics) Ovomucoide (Gal d 1) Ovoalbúmina (Gal d 2) Lysozyma (Gal d 4) Alfa lactoalbumina (Bos d 4) Beta lactoglobulina (Bos d 5) Caseína (Alfa, beta, kappa)

40. n=130 145 provocaciones DBPCFC PP abierta PP realizadas PP positivas Leche 85 42 (49%) Huevo 60 45 (75%)

41. Asociación entre el nº de componentes reconocidos en el microarray y CAP frente al extracto

42. PP como parámetro de referencia para análisis de curvas ROC para PC , CAP y Microarray LECHE

43. HUEVO

44. LECHENo encuentran dif significativas entre los valores de área bajo la curva (AUC) entre PC, CAP y Microarray

45. HUEVOSolo el Gal d 4 (lisozima) arroja valores inferiores de AUC, respecto al extracto completo El resto de componentes, respuesta similar La combinacion de todos en Microarray similar a CAP y PC

46. Puntos de decisión clínica LECHE n=85 HUEVO n=60

47. Ninguna prueba in vivo o in vitro permite el diagnostico definitivo en el 100% de los casos de Alergia alimentaria Los microarrays frente a componentes de leche y huevo nos dan resultados equivalentes a los encontrados con PC y/o IgE esp Ningún componente exclusivo discrimina entre una sensibilización irrelevante y una sensibilización genuina

48. Leche Frecuencia de reconocimiento de alérgenos en alérgicos y no alérgicos Perfiles de reconocimiento de Ag leche en alérgicos y no alérgicos 40 sueros con IgE total entre 72 y 18591 kIU/L e IgE específica a proteínas de leche entre 3 y 190 kIU/L. 6 sueros con IgE total entre 66 y 13242 kIU/L y sin alergia a leche, como controles negativos. Tecnica uarray propia Lactoferrina bovina es un Ag mayoritario en alergia a leche. Caseinas: alfa s1 es mas alergénica

49. Pediatric allergy Immunol 2007 sIgE trigo sIgG4 trigo Dermatitis atópica por alimentos con PP positiva o negativa IgE, IgG4 Ag-específica mediante microarrays (tecnica propia) para leche, clara de huevo, soja y trigo. La media de los valores IgE/IgG4 es mayor en el grupo PP + El valor IgE/IgG4 podría indicarnos la gravedad y el progreso de la dermatitis atópica de un paciente y ser mejor indicador que la IgG absoluta.

50. Mapeo de Epitopos. Microarray Peptidos LECHE CACAHUETE • Flinterman AE, Knol EF, Lencer DA, Bardina L, den Hartog Jager CF, Lin J et al. Peanut epitopes for IgE and IgG4 in peanut-sensitized children in relation to severity of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol 2008; 121(3):737-43. • Shreffler WG, Beyer K, Chu TH, Burks AW, Sampson HA. Microarray immunoassay: association of clinical history, in vitro IgE function, and heterogeneity of allergenic peanut epitopes. J Allergy Clin Immunol 2004; 113(4):776-82. • Shreffler WG, Lencer DA, Bardina L, Sampson HA. IgE and IgG4 epitope mapping by microarray immunoassay reveals the diversity of immune response to the peanut allergen, Ara h 2. J Allergy Clin Immunol 2005; 116(4):893-9. • Cerecedo I., Zamora J., Shreffler G.W., Lin J, Bardina L, Dieguez M.C. et al. • Mapping of the IgE and IgG4 sequential epitopes of milk allergens using a peptide microarray-based immunoassay. J Allergy Clin Immunol 2008.122:589-594 Estudios de perfiles de sensibilización frente a epítopos diversos o fracciones de proteínas útiles en predecir la historia natural de la alergia alimentaria Jarvinen et al JACI 2002 Jarvinen et al JACI 2007 Vila et al CEA 2001