1 / 64

Mutace a opravy DNA, rekombinace ( kapitola 23, 24)

Molekulární biologie. 10. Mutace a opravy DNA, rekombinace ( kapitola 23, 24). MUTACE. změny genetického materiálu daného organizmu ( dědičné u potomků dané buňky ) v ětšina mutací není letální , ani se na fenotypu neprojeví . Některé mutace dokonce přinášejí organizmu výhodu .

dinesh
Télécharger la présentation

Mutace a opravy DNA, rekombinace ( kapitola 23, 24)

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Molekulárníbiologie 10. Mutace a opravy DNA, rekombinace (kapitola 23, 24)

  2. MUTACE • změnygenetickéhomateriáludanéhoorganizmu (dědičné u potomkůdanébuňky) • většinamutacíneníletální, ani se nafenotypuneprojeví. Některémutacedokoncepřinášejíorganizmuvýhodu. • mutace v somatickýchbuňkáchnejsoudědičné, pouzemutace v zárodečnýchbuňkách • vetšinamutací je recesivních, efektvykompenzovándruhoualelou • Každýčlověknese v genomu 75-100 škodlivýchrecesivníchalel, z toho 8 letálních. Kdybyčlověkexistovaljako haploid, byl by dávnomrtvý! • K tomumákaždýčlověk v genomuasi 20.000 změn, kteréjsou ale neškodné • Nulovámutace – úplněchybíproduktdaného genu, loss of function • Tichámutace – nemávlivnafunkcidaného genu, bezfenotypu, např. vetřetípozicikodonu, v intronech, v intergenové DNA • Substitucebáze • Inserce • Delece • Inverse • Duplikace • Translokace uvnitř genu nebo v regulačníchsekvencích

  3. Substitucebáze bodovámutace

  4. Missensemutace– změníkódovanouaminokyselinu v proteinu radikálnímutace (nahrazeníaminokyselinou s velmirozdílnýmivlastnostmi, vlivnastrukturu a tímfunkciproteinu) neutrálnímutace (nahrazeníaminokyselinou s podobnýmivlastnostmi) Aminokyselinykonzervovanéu rozdínýchorganizmůbudou dost možná v aktivnímmístěproteinu a jejichmutacebudemítzávažnějšídůsledkynežmutaceostatníchaminokyselin.

  5. Kondicionálnímutace – efektzáležínapodmínkách, vekterýchorganizmusžije např. teplotněsensitivnímutace – projeví se jenpřiurčitýchteplotách Mutace v melaninu, která ho děláaktivnějšímvchladnějšíchčástechtěla.

  6. Nonsensemutace – zavedenípředčasného stop kodonu v mRNA např. UCG UAG ser stop Prokaryota – protein je syntetizovánaž do předčasného stop kodonu, pakuvolněn, ale protoževětšinounenísprávněsložený, je degradován Eukaryota – nonsense mediated mRNA decay, zničí se rovnou mRNA Nonsense mutace = většinouefektjakonulovámutace

  7. Delece Efektvětšídelecemůžebuďinaktivovatgenyneboijejichexpresizvýšit (delecevazebnéhomísta pro represor) Delecejednéčiněkolikabazí – frameshiftvečtecímrámcinebovlivna splicing, vlivnavazbutranskripčníchfaktorůatd.

  8. Frameshift -1 Frameshift -2 Frameshift -3

  9. Inzerce Inzercemobilníhogenetickéhoelementu (transposony, retrotransposony), virů, nebochemickýmimutagenyčichybou DNA polymerázy zastaveníexprese zvýšeníexprese

  10. Inverze Translokace Duplikace

  11. Spontánnímutace chyby v DNA replikaci, spontánníchemickézměnyna DNA (s nízkoufrekvencí, se zvyšující se teplotoufrekvenceroste) Indukovanémutace Mutageny: chemickélátky, radiace, teplo Chemickémutageny: • EMS (ethyl methane sulphonate) • alkylačníčinidlo, přidáváethylovéskupinybazím • pro in vivo mutageneziživýchbuněk • Dusitany(NO2-) • přeměnaaminoskupinnahydroxyskupiny • mutace5-methyl cytosinunathymin • pro in vitro mutageneziplazmidů

  12. Analogy bází • 5-bromouracyl • inkorporuje se do DNA běhemreplikacejakothymin • existujevedvou flip-flop stavech, z nichžjeden se páruje s A a jeden s G • problémpřinásledné DNA replikaci, kdysloužíjakotemplát

  13. Interkalačníčinidla • acridine orange, acriflavin, ethidiumbromid • vmezeří se mezidvěbáze DNA • DNA polymerázaběhemreplikacepakrozeznátutolátkujakoskutečnoubázi a vloží extra nukleotid do DNA, frameshift… Teratogen – látkazpůsobujícívývojovévadyembryí (buďjako mutagen nebojinýmimechanizmy)

  14. Mutacezpůsobenéradiací: • elektromagentickévlnění s velmivysokoufrekvencí(UV) • UV světlomávlnovoudélku 100-400nm, bázeabsorbujínejvícepřivlnovédélce 254nm, tvorbathyminovýchdimérů, problémpřireplikaci • většina UV zesluncezachycenaozonovouvrstvou, pokudnenípoškozená… Thyminovédiméry thymin thyminový dimer • ionizačnízáření(X-ray, g-ray) • přistyku s vodoučijinýmilátkamiindukujítvorbuiontů a volnýchradikálů (hlavně OH.) = nepřímépoškození DNA • taképřímépoškození DNA, přímoureakcízáření s DNA (hlavně ds zlomy)

  15. SPONTÁNNÍ MUTACE Mutacevznikléchybami DNA polymerázy • proofreading aktivita DNA polymerázynenídokonalá, s maloufrekvencízůstávajíbehěmreplikace v DNA chyby • uE.colibehěmreplikace leading stranduzařadípolymerázaprůměně 1 špatnoubázi z 10 milionůzreplikovaných, u lagging strandu 20x více (protože DNA PolImámáhorší proofreading aktivitu) • navícmůžedocházeti k ‘uklouznutí’ polymerázy (polymerase slipping): zavedenídelecíneboinzercí

  16. Mutacekvůlipárovánípodobnýchúseků DNA a následnérekombinaci přímérepeticena DNA rekombinace(mezidvěmatotožnýminebovelmipodobnýmisekvencemi) DELECE a DUPLIKACE DELECE

  17. obrácenérepeticena DNA INVERZE

  18. Mutacekvůlitautomerizacibazí • každábázeexistujejakoketo a enol forma – tautomery • vevzájemnérovnováze, ale značněpřevažujíketoformy • pokudpřireplikacibázezrovna v enolformě, budezařazena v nesprávnémpárování

  19. Mutacekvůlispontánníchemickéinstabilitěbazí A, G a C mohoupomaluspontánněztrácetsvéaminoskupiny = DEAMINACE 100 bazíza den v každéeukaryotníbuňce! záměnaCzaT Cytosin je horkýmmístemmutací v DNA ! deaminace G a A mnohemvzácnější

  20. Mutacekvůlispontánníchemickéinstabilitěbazí A a G se mohouspontánněhydrolyzovat od DNA kostry = DEPURINACE 5000 bazíza den v každéeukaryotníbuňce!

  21. Poškozeníoxidativnímstresem(volnýmiradikály, např. běhembuněčnéhometabolismu) formace8-hydroxyguaninu párování s A záměna G/C za A/T Poškozeníneenzymatickoumetylací S maloufrekvencímůže donor metylačníchskupin (S-adenosylmethionin) spontánněmetylovatbáze adenin 3-methyladenin

  22. OPRAVY DNA Prokaryota

  23. Proofreading aktivitaDNA polymeráz se snažíeliminovatšpatnépárováníběhemreplikace Mismatch v párováníbazí, jejichchemickémodifikacenebovýskytanalogůbazívede k distorci DNA Mismatch repair system a excision repair system detekujítytozměnystruktury DNA spíšenežspecifickéchemickézměny Jakreparačnísystémypoznají, kterázedvounesprávněspárovanýchbazí je ta správná?

  24. Jakreparačnísystémypoznají, kterázedvounesprávněspárovanýchbazí je ta správná? Je třebaumětrozeznatpřireplikaciparentální DNA vlákno od nověreplikovaného Bakteriální DNA metylázymetylujíparentálnívlákno DNA dam (DNA adenine methylase) - GATC dcm(DNA cytosine methylase) – CCAGG nebo CCTGG 6-methyladenin a 5-methylcytosin se párujísprávně, neindukujíreparačníodpověd’

  25. několikminutporeplikaci je nová DNA šroubovicehemimetylovaná nastupujíreparačníenzymy a hledajíchyby v nemetylovanémvlákně dam a dcmmetylázymetylujíinovévlákno

  26. DNA mismatch repair system (MMR system) rozpoznáníchybnébázepomocíMutL , MutS a MutHproteinů zavedenízlomu v novém DNA vlákně odstraněníúseku DNA kolemchybnéhopárování dosyntetozovánísprávnébáze DNA polymerázou III (nebod u eukaryot)

  27. Nucleotide excision repair system (NER system) • nejčastějšísystémopravpoškozené DNA • rozpoznávázměnystruktury DNA, ale méněsenzitivnínež MMR (změnystrukturymusejíbýtvícenápadné) • předevšímopravy DNA poškozenéUV = thyminovédimery, kroslinkovanébáze rozpoznáníchybnébázepomocíuvrA,B,Cproteinů zavedenídvouzlomůokolo T=T odstraněníúseku DNA kolemchybnéhopárování a dosyntetozovánísprávnébáze DNA polymerázouI

  28. Base excision repair system (BER system) • rozeznáváspecifickéchemickézměny v DNA, která se neprojevínazměněstruktury DNA • opravujebáze, které se normálně v DNA nevyskytují (nenípochyb o tom, žejsoušpatné) Deaminaceadeninunahypoxantin, guaninunaxanthin, cytosinunauracil: DNA glykosylázaodštěpíchybnoubázi, vzniknemístobezbáze (AP místo) AP endonukleázaštěpíkostru DNA DNA polymeráza I dostavímezeru

  29. Oxidaceguaninuna 8-oxoguanin: MutTfosfatázaodstraňujefosfátovéskupiny z oxoGTPnukleotidů, aby se nemohlyinkorporovat do DNA MutMglycosylázaodstraňujeoxoG z DNA (pokud se párujesprávně s C) MutYglycosylázaodstraňujeA z DNA pokud se páruje s oxoG Vzniklé AP místodostavěné DNA polymerázou I

  30. Very short patch repair system Thyminvzniklýspontánnídeaminací 5-methyl cytosinu (ne běhemreplikace DNA) je horkýmmístemmutací (změna CG naTA) • uE.coli je 5-methylcytosin hlavně v místechmetylovaných dam a dcm • pokud se T vyskytne v sekvencíchrozeznávaných dam a dcmmetylázami (CCAGG a CCTGG), je odstraněnVsrendonukleázou Sebevražednédemetylázy Metylovéskupinynakyslíku u O6-methylguaninu a O4-methylthyminu odstraněnysebevražednýmienzymy, kterémetylovouskupinupřenesounasebe. Báze je tímrovnouopravena, ale enzymlzepoužítpouzejednou. Ostatnímetylovanébázeodstraněny DNA glycosylázami

  31. Photoreaktivačnísystém opravathyminovýchdimerů(opravytaképomocí NER systému, Uvrproteiny) Přímáoprava, rozštěpenídimeru, bezpoužitípolymerázy Fotolyáza– absorbujeviditelnésvětlo o vlnovédélce 350-500nm (modré) a jehoenergiipoužívározštěpeníthyminovéhodimeru = fotoreaktivace

  32. Opravypomocírekombinace Ne všechnychyby DNA se podaříodstranitpředprůběhemreplikace. Pokudmutacebránípostupu DNA polymerázy (napříkladpřítomnostthyminovýchdimerů), polymerázaodpadne a začnesyntézuopět o kousekdál Vzniknejednořetězcovámezera v replikovanémchromozomu RecA Rekombinacemezi ‘zdravým’ vláknemnadruhémchromozomu a vláknem s mezerou Mezeradostavenapodlezdravéhovlákna, thyminový dimer siceneopravený, ale obachromozomyzreplikoványbezmezer

  33. SOS reparačnísystém Pokud je DNA poškozenánamnohamístech a běhemreplikacevzniká hodně jednovláknovýchoblastí, SOS systémumožníprůběhreplikacedosyntetizovánímtěchtoúseků, ikdyž to pravděpodobnězavedemnohomutací RecA se aktivujevazbounassDNA lexA dimer blokuje expresi SOS genů RecArozštípeLexArepresor lexA je zničen, spustí se exprese SOS genů např. DNA polymeráza V, nemá proofreading activitu, takžemůžreplikovatithyminovédimery a místabezbází (AP místa) Pouze u bakterií, pro Eukaryotapřílišnebezpečnéreplikovatbuňky s mnohamutacemi (rakovina), radějiapoptozaneboinhibicedělení

  34. Opravaspřažená s transkripcí (transcription coupled repair) Pokud je DNA hodně poškozená, můžebránitprůběhutranskripce, RNA polymeráza se zastaví, začneopravatemplátovéhovlákna Bakterie: TRCF protein rozpoznávázastavenoupolymerázu (transcription repair coupling factor) Eukaryota: TFIIHrozvolňuje DNA běhemtranskripce, pokud’narazínapoškozenou DNA, navážeproteiny excision repair systému (NER)

  35. Opravy u Eukaryot Systémypodobnéjako u prokaryot, ale méněprozkoumané Mutace v reparačníchgenechjsoudoprovázenévyššívýskytemrakoviny: hMSH2 (human MutS homologue 2) – mismatch repair system, vznik malýchdelecí a inzercí BRCA1 (breast cancer A1) – zlomydsDNA, transkripčníreparace Xerodermapigmentosum mutace v genech pro excision repair system, vysokásenzitivitakůže k UV záření

  36. Problémy s opravami DNA vedoukezvýšenénáchylnosti k rakovině a k předčasnémustárnutí Wernerůvsyndrom PředčasnéstárnutízpůsobenémutacíveWnr genu – specifickéhelikázypoužívanépřiopravách DNA

  37. DNA damage checkpoints Přikaždémdělení se napřechodech G1/S a G2/M a také v S kontrolujeintaktnost DNA ATMkináza – detekujedvojřetězcovézlomy ATRkináza – detekujezastavenéreplikačnívidličky Fosofrylujícelouřaduproteinůvedoucí k zastaveníbuněčnéhocykluneboapoptosenapř. p53

  38. Opravydvojřetězcovýchzlomů Non homologous end joining ZlomydsDNAionizačnímzářením, chemickynebopovyštěpenítranspozonů eukaryota VazbaKuproteinůnakoncedsDNA VazbaDNA-PK (DNA protein kinasy) Fosforylace XRCC4, díkytomunavázáníligázy a spojení DNA Můžespojitomylemi DNA, která k soběnepatří, chromozomálnítranslokace dsDNAzlomymožnoopravittéžhomolognírekombinací(vizdále)

  39. Horkámístamutací Ne všechnamísta v genomujsoustejněnáchylná k mutacím, některámístamajífrekvencidalekovyšší. Vetšinoumístavýskytu5-methylcytosinu, kterýobčasspontánnědeaminujenathymin a páruje se pak s A místo s G.

  40. Reverzefenotypu Fenotypvzniklýurčitoumutací je vrácen do normálníhostavu Šance, že by danýnukleotidspontánnězmutovalzpětnapůvodnínukleotid je velmimalá Mnohemčastěji je reverzefenotypuzpůsobenajinoumutací, kterávyrušíúčinekprvní = supresorovámutace(aťužvestejném genu nebo v jiném)

  41. SupresorovétRNA • nabitétRNA, které ale majízmutovanáantikodon, takžerozeznává STOP kodon(např. tRNA pro glycin, kdeantikodon GAC zmutovalna AUC) • Mohoučástečněobnovitexpresigenů s předčasným stop kodonem, běžné u prokaryot a kvasinek • PouzepokudexistujevícetRNA pro tutéžaminokyselinou, jinak by mutacekodonubylaletální Důsledkem je prodlouženíinormálníchproteinů, cožmůžebýtproblém.

  42. REKOMBINACE

  43. Rekombinace Výměnagenetickéhomateriálumezichromozomynebonebojinýmimolekulami DNA U eukaryotpřimeioze, přiopravách DNA, u bakteriípřikonjugaciplazmidu crossing over – zlom v DNA a jejíspojení s jinoumolekulou (zdedvojitýcrossing over)

  44. Homolognírekombinace - mezidvěmavelmipodobnýmiskevencemi Nehomologní (místněspecifická) rekombinace – mezijinaknepodobnýmisekvencemi, ale iniciovánonakrátkémúsekuhomologierozpoznávanémspecifickýmiproteiny

  45. Holliday junction Crossing over dvoujednovláknovýchřetězců DNA a jehoposunpodélchromozomu Následujedalšíštěpení a separacevláken, může a nemusívést k výměněcelých ramen nachromozomu:

  46. Holliday junction se můžeotáčet do dvouizomerníchstavů Patch recombinant Vymění se pouzečástjednohovlákna resolváza (rekombináza) – štěpí a liguje DNA v Holliday junction True recombinant Vymění se celýzbytekchromozomu

  47. Crossingover / video http://booksite.academicpress.com/Clark/molecular2/anim24_crossoverformation.php

  48. Jak se homolognísekvencenajdou a spárují ? Bakterie: zlom v dsDNA a invazejednořetězcovéhovlákna 1. RecBCDkomplexnasedánazlomydsDNA 2. Postupujepo DNA, dokudnenarazína Chi sekvenci(GCTGGTGG, časté) 3. RecCodštěpíjeden z řetězců DNA 4. RecBCpostupněodhalujessDNA s volným 3’koncem, ta se pokrývá RecAproteiny:

  49. Zlomy v dsDNA = většinou ne zlomy v genomické DNA, ale v cizorodéDNA vniklédo buňkypřitransformaci, transdukciviry, konjugaci ssDNAvlákno s volným 3’koncem se pokrýváRecAproteiny … a atakujedsDNAhomologní DNA molekuly Dočasnévytvořenítriple helixu VytěsněnéssDNAvláknose pakspojí s ssDNAdruhémolekuly

More Related