PCR - polymerase chain reaction

1. PCR - polymerase chain reaction Prinsipp og metode

2. PCR - prinsipp • PCR er primer-mediert enzymatisk amplifisering av spesifikke DNA-sekvenser (genomisk eller klonet) • ca. 10 år gammel metode som har revolusjonert molekylærbiologien (og gitt Nobelpris til Kary Mullis) • Syklisk prosess av tre trinn • denaturering av dsDNA templat • annealing av to motsatt rettede primere til ssDNA templat • elongering av ny komplementær DNA v.hj.a. varmestabil DNA polymerase • Akkumulering av dsDNA med eksponesiell hastighet • Hver syklus skulle i teorien doble mengden DNA • I praksis er effektiviteten av hver syklus <1 slik at Y = X (1 + eff.)n • Amplifisering når et platå etter 105 til 109 fold økning

3. PCR - prinsipp En syklus Denaturering 94oC 72oC Elongering Tid Tid Temp. 55oC Annealing

5. Dobling trinn for trinn

6. Eksponensiell amplifikasjon

7. Eksponensiell økning PCR-basis: N = N0 x 2n • N: antall amplifiserte molekyler • N0: opprinnelig antall molekyler • n: antall sykler Amplification curve

8. Bruk • Analytisk • Påvise nærvær av en spesifikk sekvens i et biologisk materiale • Spesifisitet bestemt av primere, forventet størrelse, eventuelt hybridisiering • Medisin - diagnostikk (f.eks påvise mutasjoner knyttet til sykdom), • Mikrobiologi - påvise mikroorganisme, • Rettsmedisin - biologiske spor, • Arkeologi osv. • Syntetisk • Verktøy for å modifisere DNA • Innen forskning: Lett å legge til startkodon, stoppkodon, restriksjonsseter, mutagenese

9. PCR enzymer • Varmestabil DNA polymerase • dNTP  DNA templatavh. primeravh. • Vanlig brukte • Taq DNA pol. • Vent DNA pol. • Pfu DNA pol. • 5´-3´-Exonuclease • Degraderer nedstrøms primer - lineære templater optimalt • 3´-5´-Exonuclease • Proofreading - korrigerer feilinkorporeringer • Taq uten proofreading, Vent og Pfu med proofreading

10. Primere • Typisk lengde 15 -28 nukleotider • 50 - 60% GC • Tm bestemmes av sekvens og reaksjonsbetingelser • Tm = temp hvor 50% av primer har hybridisert (dsDNA) og 50% er fri (ssDNA) • Kan grovt estimeres som Tm = 2x [#AT-bp] + 4x [#GC-bp] • Kan mer presis estimeres av dataprogrammer • Salt stabiliserer: Tm avtar med fallende ionestyrke • Optimal annealingstemp = Tm - 5˚C • normalt mellom 55 og 72 ˚C • Balansert Tm for de to primere • Konsentrasjon: 0.1 - 0.5 µM • For høy kons fremmer misinkorporering, falsk priming og primer-dimer dannelse

11. Primere - kriterier for design • Annealing av primer til templat kritisk trinn i prosessen • optimalt: bare annealing til spesifikke områder • i praksis: også falsk priming til uspesifikke områder • Unngå komplementære 3´-ender - fremmer primer-dimer • 40 - 60 bp produkt • forbruker primere og enzym, reduserer utbytte • Unngå G-serier og C-serier (> 3nt) i 3´-enden • fremmer falsk priming i GC-rike områder • Unngå interne palindromer

12. Primernes 5´-ende: sted for tillegg • 5´-ende av primerne trenger ikke være komplementære med templat DNA • Blir presist inkorporert i sluttprodukt • Egnet til å legge til restriksjonskuttesteder, promotersekvenser, ATG-translasjonsstart, stop kodons osv. ATG Stopp PCR Restriksjonskuttested ATG Gen Stopkodons Restriksjonskuttested

13. DNA templat • Renhet ikke kritisk • En av fordelene med PCR er nettopp at spesifikke DNA-molekyler i en kompleks blanding kan amplifiseres (nåla i høystakken identifiseres ved å amplifisere nåla) • Basis for bruk av PCR i kriminalsaker • Kurset: amplifisere direkte fra en bakteriekoloni • Forurensinger kan inhibere DNA polymerasen • Mengde • 1 molekyl nok • 100.000 molekyler anbefales • nanogram mengder av klonet DNA • mikrogram mengder av genomisk DNA • Også RNA kan brukes • omdannes til ssDNA templat via revers transkriptase

14. PCR-maskiner og rør • Maskiner: programmerbar varmeblokk • “Hold-time” må være tilstrekkelig til temp.likevekt • PCR-rør: tykkelsen av plastveggen bestemmer tid for temp.likevekt • polypropylen tynnveggede optimalt • Ned til 15 sek ekvilibreringstid • Problem med fordampning: • Oljedekke over • Varme i lokk hindrer kondensasjon og væsketransport Olje PCR-mix Varme i lokk hindrer kondens PCR-mix

15. Valg av PCR-syklus • Denaturering temp. og tid • 94 ˚C i 5 min., 95 ˚C i 30 sek., 97 ˚C i 15 sek. • For høy: enzymet inaktiveres • For lav: snapback av templat • Annealingstemp. og tid • Temp. justeres for hvert sett av primere • Tid: 30 sek nok • Elongeringstemp. 72 ˚C • Elongeringstid • 35 -100 nt pr sek • Justeres for hver reaksjon utfra regel om at man pr minutt kan lage 1- 2 kb DNA • Kan økes utover i programmet når enzym/templat ratio avtar • Antall sykler • Med størrelsesorden 105 templatmolekyler brukes 25 -30 sykler • Bruk ikke flere enn nødvendig (bakgrunn øker) Denaturering 94oC 72oC Elongering Tid Tid Temp. 55oC Annealing

16. Optimalisering av reaksjonsbetingelser • Mg++ konsentrasjon • DNA pol. krever fri Mg++ • [Mg++ ] påvirker flere trinn (annealing, polymerase osv) • Flere komponenter i blandingen (særlig dNTP) binder Mg++ . Viktig at det er tilstrekkelig overskudd av fri [Mg++]. • Ved optimalisering: varier [Mg++] i trinn på 0.5 mM • dNTP (ekvimolar blanding av dGTP, dATP, dCTP, dTTP) • Optimalt mellom 20 og 200 µM • 20 µM i 100 µl nok til 2.6 µg DNA (400 bp) • Lav konsentrasjon best mhp spesifisitet og fidelitet • Stabilitet: 50% igjen etter 50 cycler

17. Optimalisering av reaksjonsbetingelser forts • Buffer og salt • 10 - 50 mM TrisHCl som buffer • pH 8.3 justert ved RT (husk temp avh.: gjennom sykler 6.8 - 7.8) • Opptil 50 mM KCl for å fremme primer annealing (for høy salt hemmer enzym) • Enzymmengde • Taq DNA pol.: 1 - 2.5 enheter • Ved optimalisering: varier fra 0.5 - 5 enheter pr. 100 µl • For mye enzym: uspesifikke produkt • For lite enzym: lavt utbytte • Andre tilsetninger • BSA for å stabilisere enzymet • Ikke-ioniske detergenter (Tween 20) også for å stabilisere enzymet • DMSO eller glycerol kan ha fordelaktig effekt på vanskelige templater

18. Analyse av PCR-produkt • Agarosegel elektroforese Forventet Størrelse - et bånd Mange ekstra bånd Bånd av feil størrelse Troubleshooting?

19. Troubleshooting • Problem: ingen produkt • TILTAK: • Optimalisering av reaksjonsbetingelser (titrere enzym, Mg..) • Optimalisering av temperaturer / tider i PCR programmet • Problem: falske produkt • TILTAK : • Høyere annealingstemp. • Hot start • “Strupende” betingelser: mindre enzym, mindre dNTP, færre sykler • Renslighet (“carryover” problematikk) • Problem: primer-dimer • TILTAK : som over + design • Problem: PCR-genererte mutasjoner • TILTAK : • Proofreading enzym • Blanding av proofreading enzym og Taq • Senke dNTP konsentrasjon

20. Stringens • Hot start • Tilsetning av enzym etter oppvarming hindrer elongering av falsk priming • Voks • holder komponenter adskilt inntil temp blir så høy at voksen smelter • Inaktivt enzym (AmpliTaq Gold) • reaktiveres etter inkubering ved 92-95 ˚C i 9-12 min • Mix av enzymer • Taq + proofreading varmestabil polymerase • Den siste korrigerer feilinkorporering som stopper elongering

21. RT-PCR • Mye brukt anvendelse av PCR • for å detektere og kvantitere eukaryote RNA species isolert fra ulike vev eller cellulære kilder. • To trinn • 1. Første-tråd cDNA syntese med revers transkriptase, dNTP og primer • 2. PCR • Primer til første-tråd cDNA syntese • pd(N)6 Primer (random hexamers) • Not I-(dT)18 RT PCR

22. Real-time PCR: PCR til kvantitering av RNA/DNA • RNA isolering • cDNA-syntese • PCR med fluorescense deteksjon • Analyse med real-time PCR på et instrument som har on-line deteksjon av fluorescence

23. Deteksjon av PCR-produkt mens de dannes via fluorescense Alternativ II: Hybridiserings-prober måling av akkumulert spesifikk DNA Alternativ I: SYBR-green måling av akkumulert total DNA

24. Real-time PCR: prinsipp for kvantitering Mye templat Instrumentet genererer en lineær standard kurve som gir sammenhengen mellom utgangsmengder templat og antall PCR-sykler Mindre templat Standard curve Formula for compared reactions Med en serie av kjente mengder input, lages en standardkurve som ukjente prøver kan kvantiteres utfra. n linear Noiseband = log N0 + n log2 Starting amount (known or estimated) # cycles at cross-point (measured) Log N0