Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

1. ASSICURAZIONE DI QUALITÀ NEL LABORATORIO CHIMICO: VALIDAZIONE DEI METODI DI ANALISI E. DESIMONI, B. BRUNETTI Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

2. Introduzione Ogni analisi chimica è richiesta per risolvere un problema. Tecnica, metodo, procedura ed eventualmente protocollo di analisi devono essere scelti in base alle necessità del committente (tempo necessario, qualità del risultato, costo). La validazione permette di verificare se quanto scelto e messo a punto dal laboratorio è effettivamente adatto all’utilizzazione prevista ed a soddisfare le esigenze del committente. Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 2

3. Introduzione Scopi della validazione di un metodo di analisi chimica sono: provare l’adeguatezza della procedura in esame; documentare la competenza dell’operatore a condurre il lavoro (per mezzo della verifica dei parametri di qualità ottenuti mediante adeguate procedure); fornire dati sufficienti alla definizione dei limiti di controllo utili alla verifica del rispetto dei parametri di qualità durante il lavoro giornaliero. Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 3

4. Introduzione L’importanza della validazione dei metodi d’analisi è sancita dalla norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025. (dalla UNI CEI EN ISO/IEC 17025) … 5.4.5 Validazione dei metodi 5.4.5.1 La validazione è la conferma attraverso esame e l’apporto di evidenza oggettiva che i requisiti particolari per l’utilizzazione prevista siano soddisfatti. 5.4.5.2 Il laboratorio deve validare i metodi non normalizzati, i metodi sviluppati/progettati dal laboratorio, i metodi normalizzati utilizzati al di fuori del proprio scopo e campo di applicazione prefissato, come pure estensioni e modifiche di metodi normalizzati per confermare che i metodi siano adatti all'utilizzazione prevista. La validazione deve essere estesa in modo da soddisfare le esigenze di una data applicazione o di un campo di applicazione. Il laboratorio deve registrare i risultati ottenuti, le procedure utilizzate per la validazione, così pure una dichiarazione circa l'idoneità del metodo per l'utilizzo previsto. … Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 4

5. Introduzione (dalla UNI CEI EN ISO/IEC 17025) • Nota 1: La validazione può comprendere procedure per il campionamento, la manipolazione e il trasporto. • Nota 2: Le tecniche utilizzate per la determinazione della prestazione di un metodo dovrebbero essere una, o una combinazione delle seguenti: • taratura, utilizzando campioni o materiali di riferimento; • confronto dei risultati ottenuti con altri metodi; • confronti interlaboratorio; • valutazione sistematica dei fattori che influenzano il risultato; • stima dell’incertezza dei risultati sulla base della conoscenza scientifica dei principi teorici del metodo e dell’esperienza pratica. • Nota 3: Quando sono effettuati dei cambiamenti nei metodi non normalizzati validati, l’influenza di tali cambiamenti dovrebbe essere documentata, e se necessario, dovrebbe essere eseguita una nuova validazione. Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 5

6. Introduzione (dalla UNI CEI EN ISO/IEC 17025) 5.4.5.3 Il campo e l'accuratezza dei valori ottenibili da metodi validati (per esempio l'incertezza dei risultati, i limiti di rilevazione, la selettività del metodo, la linearità, la ripetibilità e/o la riproducibilità, la robustezza nei confronti di influenze esterne e/o la sensibilità incrociata nei confronti di interferenze provenienti dalla matrice del campione/oggetto da provare), così come valutati per l'utilizzo previsto, devono corrispondere alle esigenze del cliente. Nota 1: La validazione comprende la specifica dei requisiti, la determinazione delle caratteristiche dei metodi, un controllo che i requisiti possano essere soddisfatti utilizzando il metodo e una dichiarazione relativa alla validità. Nota 2: In funzione dello sviluppo del metodo, dovrebbero essere eseguiti riesami regolari per verificare che le esigenze del cliente continuino ad essere soddisfatte. Qualsiasi variazione dei requisiti che richieda modifiche al piano di sviluppo dovrebbe essere approvata e autorizzata. Nota 3: La validazione è sempre un bilancio fra i costi, i rischi e le possibilità tecniche. Vi sono molti casi in cui il campo e l'incertezza dei valori (per esempio l‘accuratezza, i limiti di rilevazione, la selettività, la linearità, la ripetibilità e la riproducibilità, la robustezza e/o la sensibilità alle interferenze) possono essere solo forniti in modo semplificato a causa di mancanza di informazioni. Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 6

7. Introduzione Esempi di situazioni sperimentali richiedenti la validazione: • un nuovo metodo analitico è sviluppato per scopi particolari; • un metodo analitico in uso deve essere aggiornato, migliorato o esteso ad un nuovo problema analitico; • il controllo di qualità evidenzia variazioni nel tempo delle prestazioni del metodo in uso; • un metodo analitico in uso deve essere usato in un laboratorio diverso, da un operatore diverso, con una strumentazione diversa; • è necessario dimostrare l’equivalenza del metodo analitico in esame con un metodo standard. Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 7

8. Introduzione Il laboratorio deve considerare che la validazione di un nuovo metodo analitico riguarda l’intera procedura analitica totale: • Definizione generale del problema (C) • Definizione analitica del problema (C & A) • Scelta di metodo, tecnica, procedura, protocollo (A) • Campionamento (C? A?) • (Pre)trattamento del campione (A) • Analisi (A) • Valutazione dei dati (A) • Conclusioni (A) • Presentazione dei risultati (C & A) C: committente A: chimico analitico Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 8

9. Introduzione Specificità e recupero Taratura e riferibilità Accuratezza esattezza precisione Incertezza Limite di rivelabilità Campo di applicazione Robustezza  Manuale UNICHIM N. 179/0 Specificità/calibrazione Precisione ripetibilità riproducibilità Esattezza Range di lavoro Limite di rivelabilità Limite di quantificazione Robustezza Sensibilità  NMKL Procedure N. 4 Selettività/specificità Limite di rivelabilità Limite di quantificazione Range dinamico/lineare Accuratezza esattezza precisione Incertezza di misura Robustezza Recupero  EURACHEM: The Fitness for Purpose of Analytical Methods La validazione implica la valutazione di uno o più parametri di qualità del metodo analitico messo a punto o aggiornato o adottato dal laboratorio. Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 9

10. Introduzione Le procedure di validazione dipendono dal tipo di analisi da eseguire. Parametri di interesse nelle procedure di validazione analisi analisi di metodi di: qualitativa quantitativa • Accuratezza (esattezza e precisione) -  • Range dinamico e lineare - • Selettività/specificità   • Limite di rivelabilità   • Limite di quantificazione - • Robustezza   • Recupero -  Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 10

11. Introduzione Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 11 Gli strumenti tecnici della validazione: • bianco: può essere il bianco dei reagenti o il bianco del campione • campioni reali: verifica delle interferenze tipiche del lavoro di routine • materiali fortificati: utili per il ldr, il recupero, ecc. • materiali contenenti l’analita nativo • materiali caratterizzati indipendentemente • materiali standard usati per calibrazioni • materiali di riferimento (meglio se certificati) • statistica 11

12. Carte di controllo Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 12 CARTE DI CONTROLLO Quando il metodo validato è usato per condurre il lavoro di routine, è necessario assicurarsi che i parametri di qualità stimati in precedenza valgano anche per i campioni reali, e che non peggiorino nel tempo. Allo scopo è necessario mantenere il sistema analitico sotto controllo statistico, ovvero assicurarsi che il sistema analitico sia caratterizzato da fluttuazioni solo casuali attorno ad un valore di riferimento e che queste fluttuazioni (quantificate in funzione di una deviazione standard) rimangano costanti. Nel laboratorio di prova e taratura, il monitoraggio della stabilità di una procedura analitica può essere eseguito mediante l’uso di uno strumento semplice ma estremamente potente, ovvero dellecarte di controllo. La costruzione delle carte di controllo richiede la disponibilità di un materiale di controllo (CM). I CM possono essere materiali di riferimento certificati (situazione ottimale ma spesso non realizzabile), materiali preparati allo scopo dal laboratorio, bianchi o, in determinati casi, campioni reali, e devono essere disponibili in quantità sufficiente a permettere il prelievo e l’analisi di numerosi campioni di controllo (CS). La composizione complessiva ed il livello di concentrazione dell’analita nel materiale di controllo devono riflettere adeguatamente la natura chimica dei campioni reali da analizzare.

13. Carte di controllo Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 13 Nel caso più semplice, i parametri utili alla definizione dei limiti di attenzione e di azione sono ricavati analizzando un numero adeguato di volte (almeno 15 – 20 volte) lo stesso campione di controllo. La carta viene quindi posta in uso. Allo scopo, i campioni di controllo devono essere inseriti in ordine casuale, all’interno dei campioni di ogni corsa (analitica). L’analisi del campione di controllo può essere eseguita in giorni diversi, o da operatori diversi, in modo da permettere la considerazione di eventuali derive temporali o della diversa manualità degli operatori.

14. Carte di controllo Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 14 A seconda delle necessità imposte dall’utilizzazione dei risultati delle misurazioni, si può decidere di eseguire, per esempio • più di due analisi in doppio del CM per corsa • un’analisi in doppio del CM per corsa • un’analisi singola del CM per corsa Il risultato delle analisi dei CS deve essere immediatamente riportato sulla carta di controllo, e la sua accettabilità deve essere valutata in base ad opportune regole di controllo. Se il risultato dell’analisi del CS non può essere accettato, tutti i risultati relativi ai campioni reali analizzati nell’ambito della stessa corsa devono essere considerati potenzialmente errati e quindi rifiutati. Questi campioni devono essere rianalizzati dopo aver identificato le cause che hanno determinato il rifiuto del risultato del CS, ovvero dopo aver riportato il sistema analitico sotto controllo statistico. Dopo aver eseguito 10 – 15 corse, conviene ricalcolare parametri e limiti di controllo aggiungendo i nuovi risultati relativi al CS a quelli ottenuti nel corso della preparazione della carta. La nuova carta potrà essere quindi usata nelle analisi di routine.

15. Carta di Shewhart per risultati singoli Avendo eseguito le N misurazioni del CM si applicano le equazioni I valori di 1/d2 sono tabulati in funzione del numero di analisi replicate del CM eseguite in ogni corsa, n, usate per valutare il range: n 2 3 4 5 10 1/d2 0,8862 0,5907 0,4857 0,4299 0,3249 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 15 Le carte di controllo più note sono le carte di Shewhart. La più semplice è quella per risultati singoli. Per costruirla, è necessario eseguire un numero adeguato di analisi del campione di controllo (N  20), calcolare il valore medio, µ, il range mobile medio e la deviazione standard, . dove d2 è il fattore di correzione per il quale deve essere diviso il range mobile medio per ottenere . L’uso del valore di  ottenuto dal range mobile al posto di quello calcolabile tradizionalmente (mediante la nota formula per il calcolo della deviazione standard) è giustificato dal fatto che in tal modo si minimizza ogni possibile deriva temporale.

16. Carta di Shewhart per risultati singoli ESEMPIO N. 29 – Stimare i parametri di controllo,  e , per la costruzione di una carta di Shewhart per risultati singoli. Allo scopo un campione di controllo viene analizzato 25 volte (N). I risultati (u.a.) sono i seguentI: x1: 25,15; x2: 25,01; x3: 24,92; x4: 25,37; x5: 25,00; x6: 25,01; x7: 24,94; x8: 25,31; x9: 24,94; x10: 24,94; x11: 25,11; x12: 25,28; x13: 25,00; x14: 24,87 x15: 25,05; x16: 24,98; x17: 25,06; x18: 24,80; x19: 25,32; x20: 25,17; x21:24,72; x22: 24,93; x23: 25,02; x24: 25,12; x25: 25,13. Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 16 Il range mobile medio (n =2) risulta uguale a La deviazione standard risulta quindi uguale a Quella calcolata tradizionalmente sarebbe

17. Carta di Shewhart per risultati singoli Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 17 Sulla base dei parametri di controllo così stimati, è possibile disegnare la carta di controllo. Allo scopo sono riportati in grafico il valore medio e due coppie di linee a: µ+2: linea superiore di attenzione (UWL, upper warning line) µ-2 : linea inferiore di attenzione (LWL, lower warning line) µ+3: linea superiore di azione (UAL, upper action line) µ-3 : linea inferiore di azione (LAL, lower action line) Il grafico risultante è il seguente:

18. Carta di Shewhart per risultati singoli Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 18 Regole di Westgard 12s: regola di attenzione che richiede un esame ulteriore dei dati quando una misura di controllo cade fuori dell’intervallo   2s. Infatti, esistono solo 5 probabilità su 100 che un valore misurato per un campione di controllo, analizzato durante una corsa analitica, esca dall'intervallo µ ± 2s. 13s : la serie viene rifiutata quando una misura di controllo cade fuori dell’intervallo   3s. Infatti, esistono solo 0,3 probabilità su 100 che un valore misurato per un campione di controllo, analizzato durante una corsa analitica, esca dall'intervallo µ ± 3s. J.O. Westgard, P.L. Barry, Cost-effective quality control: managing the quality and productivity of analytical processes, AACC Press, Washington, DC (1986)

19. Carta di Shewhart per risultati singoli Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 19 In linea di principio, la carta di Shewhart per risultati singoli permette di evidenziare sia problemi di precisione che di bias, come evidenziato nella carta di Shewhart costruita con i seguenti risultati: 25,11; 24,80; 25,05; 24,75; 25,30; 25,15; 24,88; 25,00; 25,20; 24,95; 24,81; 24,28; 24,82; 24,65; 24,55; 24,80; 24,45; 24,27; 24,82; 24,73; 25,85; 25,11; 25,50; 24,12; 25,70; 24,22; 25,00; 24,28; 25,65.

20. Carte delle differenze • I limiti di controllo possono essere calcolati • dalla deviazione standard delle differenze • limiti di attenzione: ± 2.sd • limiti di azione: ± 3.sd • dal range medio: • limiti di attenzione: • limiti di azione: Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 20 Per costruire la carta-D, il campione di controllo (simile ai campioni in esame) deve essere analizzato n volte (n  2)nel corso diogni gruppo di analisi sui campioni reali. Le differenze tra l’ultimo ed il primo dei risultati delle analisi replicate relative al CM, eseguite in ogni gruppo di misurazioni, dovrebbero essere distribuite casualmente attorno allo zero. Nel caso di derive temporali, l’ultimo risultato sarà sempre maggiore (o sempre minore) del primo: i punti corrispondenti alle differenze calcolate analizzando i CM saranno localizzati prevalentemente sopra o sotto la linea di zero. La carta delle differenze richiede l’uso di materiali di controllo stabili! Nel caso siano usati campioni reali come CM, è essenziale verificare l’assenza di variazioni fisiche, chimiche o biologiche tra le n analisi di controllo successive.

21. Carte di controllo ESEMPIO N. 31– Nel corso dell’applicazione di un metodo FIA-PIF (Photoinduced Fluorescence detection) alla determinazione di pesticidi aromatici, si desidera verificare il mantenimento dello stato di controllo statistico. Il range medio, valutato mediante elaborazione dei risultati di 20 analisi in doppio di un campione contenente 3,8 mg/L di diflubenzuron (scelto come CM) è risultato uguale a 0,20 mg/L. I limiti di controllo utili per le due carte (P:95% e P: 99,7%) sono quindi uguali a: Durante il lavoro di routine, lo stesso campione reale usato come CM è analizzato in doppio, all’inizio (R1i) ed alla fine (R2i) di ogni corsa analitica; i risultati relativi alle 22 corse analitiche eseguite nelle prime due settimane di lavoro sono riportati qui a lato: Costruire la carta dei range e quella delle differenze. carta-R carta-D Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 21

22. Carte di controllo La carta-R, riportata a sinistra, non evidenzia variazioni temporali della precisione: il range oscilla all’interno dell’intervallo di attenzione. La carta-D, riportata a destra, permette invece di rilevare una deriva positiva dei risultati a partire all’incirca dalla corsa N. 13 o N. 14: da questo punto in poi tutte le differenze sono positive. Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 22