1 / 16

TRANSFORMACIJA BAKTERIJA

TRANSFORMACIJA BAKTERIJA. TRANSFORMACIJA BAKTERIJA. Postupak ubacivanja plazmidne DNA u kompetentne bakterijske stanice u svrhu umnožavanja DNA sekvence od interesa ili proizvodnje pročišćenih proteina

emerald-england
Télécharger la présentation

TRANSFORMACIJA BAKTERIJA

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. TRANSFORMACIJA BAKTERIJA

  2. TRANSFORMACIJA BAKTERIJA • Postupak ubacivanja plazmidne DNA u kompetentne bakterijske stanice u svrhu umnožavanja DNA sekvence od interesa ili proizvodnje pročišćenih proteina • KOMPETENTNE STANICE- bakterijske stanice smrznute u logaritamskoj fazi rasta u puferu koji sadrži Ca2+ ione • SELEKCIJA transformiranih klonova bakterijskih stanica ostvaruje se rezistencijom na određeni antibiotik sadržan na plazmidu

  3. PLAZMIDNI VEKTORI • Kružne dvolančane molekule DNA koje se mogu replicirati neovisno o genomskoj DNA bakterije • Sadrže gene za rezistenciju na antibiotike, bakterijske toksine (bakteriocini), zaštitu od teških metala, fertilnost

  4. “HEAT SHOCK” TRANSFORMACIJA

  5. TRANSFORMACIJA ELEKTROPORACIJOM

  6. VRSTE PLAZMIDA Ovisno o njihovoj funkciji: • F-plazmidi: osiguravaju bakterijsku fertilnost tj. mogućnost bakterijske konjugacije • R-plazmidi: sadrže gene za rezistenciju na antibiotike (ampicilin, kanamicin, tertraciklin, higromicin) • Col-plazmidi: nose gene za bakteriocine ( proteine koji su toksični za druge bakterije) • Degradativniplazmidi: omogućavaju razgradnju supstanci poput toluena, salicilne kiseline • Virulencijskiplazmidi: odgovorni za patogenost bakterija (hemolizin)

  7. VRSTE PLAZMIDA Ovisno o broju kopija: NISKO KOPIJSKI (“low-copy”, “stringent”): <100 kopija/stanici; njihovu replikaciju i segregaciju kontrolira bakterijski kromosom VISOKO KOPIJSKI (“high-copy”, “relaxed”): > 100 kopija/stanici; manji plazmidi koji se repliciraju neovisno o bakterijskom kromosomu

  8. VRSTE PLAZMIDA Ovisno o domaćinu: • PROKARIOTSKI: umnažaju se i izražavaju u prokariotskim stanicama • EUKARIOTSKI: umnažaju se u prokariotima ili kvascima, a izražavaju u eukariotskim stanicama (komercijalni plazmidi za genetičko inženjerstvo) Razlikuju se u promotorskoj sekvenci

  9. PLAZMIDI U GENETIČKOM INŽENJERSTVU • Jedan od prvih komercijalnih vektora • Sadrži nekoliko restikcijskih mjesta za kloniranje (BamHI, EcoRV, ..) • Gen za rezistenciju za ampicilin(amp), tetraciklin (tet) zainsercijsku selekciju • Ori (originofreplication) je izvorište replikacije

  10. PLAZMIDI U GENETIČKOM INŽENJERSTVU • Sadrži višestruko mjesto za klonirnje (MCS), ori, gen za rezistenciju na Amp • Ugradnja inserta u MCS unutar lacZoperonaspriječavaα-komplementaciju gena za enzim β-galaktozidazu . Kolonije s insertom su bijele boje

  11. PLAVO-BIJELA SELEKCIJA

  12. PLAZMIDI U GENETIČKOM INŽENJERSTVU • Plazmidi za ekspresiju u eukariotskim stanicama • Sadrže eukariotskupromotorsku sekvencu! • Sadrže dodatnu TAG sekvencu za vizualizaciju u stanicama (GFP, mCherry, myc, HA, Flag)

  13. PLAZMIDI U GENETIČKOM INŽENJERSTVU • Plazmidni vektor za proizvodnju i pročišćavanje proteina • Sustav glutathione-S-transferaze (GST tag)

  14. PROČIŠĆAVANJE GST-PROTEINA

  15. AFINITETNA KROMATOGRAFIJA GST-rekombinantnih proteina • Metoda razdvajanja i pročišćavanja proteina utemeljena na biološkoj interakciji analita i liganda • GST-rekombinantni protein se veze na glutation imobiliziran u koloni za pročišćavanje

More Related