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corso di Genomica a.a. 2010-2011 lezione 39-40

corso di Genomica a.a. 2010-2011 lezione 39-40. laurea magistrale Biotecnologia Industriale. venerdì 28 Gennaio 2011 (recupero) aula 6A. Esami: 24 Febbraio, 3 Marzo, 23 Marzo Lezioni fino al 10 Febbraio (vi prego di comunicarmi in quale appello contate fare l’esame). D. Frezza.

emiko
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Presentation Transcript

  1. corso di Genomica a.a. 2010-2011lezione 39-40 • laurea magistrale Biotecnologia Industriale venerdì 28 Gennaio 2011 (recupero) aula 6A Esami: 24 Febbraio, 3 Marzo, 23 Marzo Lezioni fino al 10 Febbraio (vi prego di comunicarmi in quale appello contate fare l’esame) D. Frezza

  2. evoluzione di HS1.2

  3. Interazioni del chroms 14 Analisi delle probabilità di interazione intra cromosomiche ed intracromosomiche

  4. Se un enhancer è polimorfico cosa potrebbe variare? Se cambiano le consensus per i fattori di trascrizione diventa un polimorfismo con un impatto funzionale - quali sono le tecniche per trovare le regioni di consensus? Chip ed EMSA (electrophoretic mobility shift assay) Mappaggio dei siti di consensus dell’enhancer polimorfico chiP trova le consensus a partire dal fattore di trascrizione con un anticorpo EMSA trova i fattori di trascrizione a partire dalle sequenze genomche individuate come HS (hyper sensitive) alla DNAse I

  5. Probe (allele*2A) 1 2 3 4 5 6 7 8 Competitor (alele*1A) Competitor (* 2A - fragment 1) Competitor (* 2A - fragment 2) Competitor (* 2A - fragment 3) a b c * * * * * * * * d NF-B Allele *1A *2A-frg2 *2A-frg3 *2A frg 1 Oct * * + - - + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + Probe (allele *2A) NE (Fleb cells) Competitor mappatura tramite competizione con “gel shift” EMSA * SP1 compete banda B NF-kB “ banda C * frgm 1 ≈ allele *1A comp B (+D) frgm 2 comp C (+D) ≈ NF-kB frgm 3 “ B (-D) * *

  6. TOR VERGATA a a b c d Probe (allele*1) Probe (allele*2) Probe (allele*2) Probe (allele*2) (227bp) (279bp) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 8 a a b c + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + PROBE - + + + - + + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + NE (Fleb Cells) - - + + + + + + + - - + + + + + + - - + + + - - + + Competitor Allele *1 Allele *2 Fragm 2 Oct1 Fragm 1 Fragm 3 Fragm 1 Sp1 Fragm 2 Fragm 3 NF-kB Oct1 NF-kB Fragm 1 Frgm 18mer Frgm mut 18mer Fragm 1-18 Fragm 1-40 Allele *2 NF-kB consensus Oct 1 consensus anti Sp1 antiboby Allele *1 (50bp) (25bp) Fragm 18 Fragm 1 Fragm 1 (50bp) competitors (50bp) (25bp) Fragm 1 -18 Mutated 18 Fragm 2 (60bp) (50bp) Fragm 1 -40 Fragm 3 (60bp) EMSA allele *1 e *2

  7. A 3’RR-B 3’RR-A   3 1  1 2 4  2  HS3A HS1,2A HS4A HS3B HS1,2B HS4B EcoRI ALLELE *1A 287 bp enhancer HS1,2 Oct1 Sp1(b) NF-B (c) EcoRI ALLELE *2A 339 bp Oct1 Sp1(b) Sp1(b) B core Oct1 Allele *1 -----GGGCACATGCAAATGGTTGTTTGTTCCACACCGAAAACATGTTTCTTGCCCTCTGAGGCTGTTTCCAGAAAT Allele *2 -----GGGCACATGCAAATGGTTGTTTGTTCCACACCGAAAACATGTTTCTTGCCCTCTGAGGCTGTTTCCAGAAAT spacer 17mer NF-B (c ) Sp1 (b) 38mer repeat Allele *1 AGCTTGCACGATTCTCCCGCCCCCTCCCCC--------------------------------------------------------------------------------------------- Allele *2 AGCTTGCACGATTCTCCCGCCCCCTCCCCCAGCGTGGCCAGGCTGGCTCAGGCCTCCAGATTCGGGGACACCCCCC spacer 17mer spacer 14mer 38mer repeat Sp1 (b) Allele *1 ----------- AGCGTGGCCAGGCTGGCTCAGGCCTCCAGATTCGGGGACACCCGCCCCCTCCCCCAGGACAGGCCCAC-- Allele *2 CACCACAGCGTGGCCAGGCTGGCTCAGGCCTCCAGATTCGGGGACACCCGCCCCCTCCCCCAGGACAGGCCCAC-- Consensus for Sp1 and NF-kB in HS1,2-A allele*1 and *2

  8. Ci sono altri polimorfismi? Il numero di polimorfismi trovati sul genoma umano è grande e la distribuzione non è completamente omogenea, però ha una frequenza maggiore di 1 per mille bp I polimorfismi sono di molti tipi nel caso di HS1.2 è rigidamente ristretto al n. di repeats dell’elemento di 40bp SNPs (single nucleotide polym.) o VNTR (vaiabel number of tandem repeats) sono i più abbondanti. In una regione regolativa possono influenzare a livello epigenetico il funzionamento e la formazione di strutture 3D

  9. RR-1 RR-2 HS3 HS3 HS4 HS4  1 1 3 2  crip2 mta1  hole crip1 4 2  HS1,2A HS1,2B  centromere A2R SA2.5 HS3 HS4 HS1,2A K10 retrovirus U2 U5 U3 Ua4 U10 Alu U16 R7 R8 U7i U14 U15 Ua2 R5 R3 U8 LTR ELK2 R2 R1 U1 U4 U6 U7 Ua3 U11 R4 R6 U12 U13 U9 R3i U6i SA2.5 U3 HS3 U4 U5 U6 U7 R3 R4 U8 HS1.2A U9 ** * * ** * * * T/C (8750*) * C/G (8705) * G/A (8339) * T/C (8283) * * * * * * * * * * G/A (7697) C/T (7662) C/T (7570) C/G (7548) A/G (7547) G/A (7538) G/C (7519) G/C (7362) G/C (7265) G/C (7159) A/G (5159) G/C (5077) A/G (4811) C/T (4690) A/C (4566) C/A (4231) C/T (4088) T/C (3906) Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me SNPs haplotype map A2R

  10. le frequenze degli aplotipi le frequenze degli aplotipi più frequenti per l’allele *1 sono uguali nel contrl. e nella Psoriasi P = 0.65 per l’allele *2 sono diverse nei contrl e nella psoriasi P = 0.028 campione piccolo n.30

  11. allele *2a allele *2b i due alleli *2a, *2b e *3a, *3B amplificazioni da DNA genomico dalle due 3’RR senza selezione allele *4 465 bp allele *3 393 bp 360 bp 339 bp allele *1 287 bp avevamo visto che nel locus 3’RR-B l’allele *3 aveva l’elemento 31mer rispetto al 17mer del locus 3’RR-A adesso abbiamo (ho) visto che anche l’allele *2 esiste nelle due forme con il 17mer ed il 31mer, cambiano le consensus!

  12. U TOR VERGATA frequenze alleliche ed epidemiologia un regolatore delle Ig polimorfico che frequenze ha nelle popolazioni Africa Asia Amer Austr Europe

  13. frequenze in 11 località italiane

  14. I livelli delle Ig nel plasma (%)

  15. alterazione delle Ig

  16. alterazione e frequenze alleliche

  17. difetto di IgA V.Giambra et al. J.Imm. vol 183 n.12; 15 Dic.2009

  18. livelli di Ig nel difetto di IgA

  19. come stanno i CD19 TABLE III. HS1.2 frequencies in IgAD patients with low or high levels of CD19+ cells, normal range 15-25% * * χ2 = 7,090; P value = 0,0289; OR = 3,604 * troppo pochi CD = cluster of differentiation

  20. se il polimorfismo condiziona nella macchina interattiva del linfocita B quale può essere il ruolo del polimorfismo di HS1,2 per ora sappiamo che interagisce in modo diverso con i complessi di SP1 ed NF-kB nella risposta immunitaria e nelle patologie immunologiche svolge un ruolo che condiziona le normali funzioni ma ci possono essere altri polimorfismi associati la 3’RR sta ad un incrocio della regolazione non più soltanto del linfocita B

  21. CLL chronic B-lymphocytic leukemia

  22. nella risposta immune esiste una diversa risposta a seconda delle freq. alleliche ** *** * * Swaziland ** Roma *** Bengasi

  23. cosa succede nelle patologie ? 165 64 65 58 37 42 233 135 135 101 44 41 86 * come combiano le frequenze alleliche di HS1,2 (* Roma)

  24. RR-1 RR-2 HS3 HS3 HS4 HS4  1 1 3 2  crip2 mta1  hole crip1 4 2  HS1,2A HS1,2B  centromere A2R SA2.5 HS3 HS4 HS1,2A K10 retrovirus U2 U5 U3 Ua4 U10 Alu U16 R7 R8 U7i U14 U15 Ua2 R5 R3 U8 LTR ELK2 R2 R1 U1 U4 U6 U7 Ua3 U11 R4 R6 U12 U13 U9 R3i U6i SA2.5 U3 HS3 U4 U5 U6 U7 R3 R4 U8 HS1.2A U9 ** * * ** * * * T/C (8750*) * C/G (8705) * G/A (8339) * T/C (8283) * * * * * * * * * * G/A (7697) C/T (7662) C/T (7570) C/G (7548) A/G (7547) G/A (7538) G/C (7519) G/C (7362) G/C (7265) G/C (7159) A/G (5159) G/C (5077) A/G (4811) C/T (4690) A/C (4566) C/A (4231) C/T (4088) T/C (3906) Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me SNPs haplotype map

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