Antibiotikumok fejlesztése a genomika segítségével

1. Antibiotikumok fejlesztése a genomika segítségével Készítette: Terecskei Kata IV.biológus

2. Bevezetés: 1940-1960-as évek: antibiotikumok ‘aranykora’ 1970-es évek: megnyertnek hitt csata 1985 óta: antibiotikum rezisztencia Methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus (MRSA) Vancomycin-rezisztens Enterococcusok(VRA) Streptococcus pneumoniae Enterococcus faecalis Multidrog rezisztensMycobacterium tubercolosis Pseudomonasok

3. Gram-negatív baktériumok antibiotikum rezisztenciája Magyarországon 1990-es évekig gyógyszeripar célja: meglevő szerek fejlesztése (pl: tetraciklinek cglicilciklinek kinolok cfluorokinolok) Genomika: új molekuláris targetek Escherichia coli, Bacillus subtilis modellek helyett direkt a patogénnel való munka.

4. Genom szekvenálás: új target azonosításának alapja • Szekvenálás automatizálása • Első publikált megszekvenált teljes bakteriális genom: Haemophilus influenzae (1995) • Mai antibiotikumok célpontja: DNS, RNS, fehérje, sejtfal-szintézis c bővülhet a hatáskör • Klasszikus módszer: cidikus vagy sztatikus vegyület keresése n Ésszerűbb target-alapú stratégia • Genomika: szekvenálás + bioinformatikai analízis

5. Target szelektálás Kritériumok: - emberben ne forduljon elő - esszenciális legyen a baktérium növekedéséhez vagy életképességéhez - expresszálódjon a fertőzés folyamán és fontos legyen abban • Target spektrum és szelektivitás: • ORF azonosítás • In silico vizsgálatok • Filogenetikai vizsgálatok (különböző fajokban, egy faj különböző izolátumaiban) In silico vizsgálat fontossága: UDP-N-acetil-glükóz-amin enolpyruvát transzferáz (MurA)

6. Esszenciális génről van-e szó? met-tRNS szintetáz polipeptid deformiláz Gén-inaktiválás: - plazmid-beépítés - transzpozon-inszerciós mutagenezis - allél-replacement mutagenezis - in vitro kondícionálisan letális mutánsok izolálása(géntermék szintjének vagy aktivitásának csökkentése) Problémák: - kapcsolat kimutatása a target gátlása és az antimikrobiális hatás között - nonspecifikus hatások - nem várt toxicitás

7. Transzkripció a fertőzés során • IVET (in vivo expression technology) • DFI (differential fluorescent induction) • STM (signature tagged mutagenesis) • microarray technika • RT-PCR alapú technika

8. Ígéretes targetek • Amino-acil tRNS szintetázok: 20 van a prokarióta sejtben c 20 új target? Mupirocin - isoleucyl tRNS szintetázt gátolja cBactrobanTM • Polipeptid deformilázok: • A deformilálás kritikus lépés a bakteriális fehérje-szintézisben, Pdf esszenciális a baktérium növekedéséhez. Jól konzervált sok patogén esetében. • Actinonin - természetben előforduló antibiotikum, Pdf-et gátolja több patogén baktériumban (de nem jó a farmakokinetikája) • Zsírsav bioszintézis: • Baktérium - de novo zsírsav bioszintézis több enzimmel • Emlős - FAS (fatty acid synthase) komplex • Kettő közt alacsony szekvencia-homológia cszelektív inhibítorok (isoniazid, thiolactomycin)

9. Antimikrobiális szerek fejlesztése a bakteriofágok genomjának segítségével

10. Staphylococcus aureus • nosocomális fertőzések • vancomicin, methycillin rezisztencia • megszekvenált genom - esszenciális gének azonosítása - hőmérséklet-szenzitív mutánsok vizsgálata - gén inaktiválási vizsgálatok c új targetek • 26 Staphylococcus aureus fág vizsgálata • 31 polipeptid család -bakteriális növekedést gátolták

11. Bakteriofágok: - bakteriális fehérjék inaktiválása - metabolikus folyamatok gátlása 77-es fág ORF104 és DnaI kölcsönhatása c kis molekulájú inhibítorok hatása

12. S. aureus fág genom 150 dsDNS bakteriofág vizsgálata: Lítikus hatás 3 csoport <20 kbp (p68 fág C1) ~40 kbp (77-es fág B1/B2) >100 kbp (G1 fág A1) Funkcionális screenelés: 77-es fág - Arzenit indukálható promóter kontrollja alá helyezett fág ORF - S. aureus ars operonjáról - kis mennyiségű 77ORF104 termék esetén is gátlás - citolitikus polipeptidek (holin, amidáz) - több fág esetében is Dot screening

13. S. aureus DnaI • 77ORF104 celluláris targetje • DNS replikáció iniciációja • 77ORF104-DnaI kölcsönhatás: DnaI azonosítása affinitás-kromatográfiával Far-western analízis Élesztő 2 hibrid analízis

14. DnaI esszenciális S. aureusban RpLLReDnaI - genetikailag módosított törzs Spac promóter RN4220 - kontroll törzs pMJ8426 plazmid - LacI-t konstitutívan expresszál

15. 77ORF104 expresszió gátolja a DNS szintézist • direkt és specifikus interakció DnaI-vel • ORF67 RNS szintézist gátol

16. Antimikrobiális szerek hatása DnaI-re • 125000 vegyület tesztelése elérhető könyvtárakból • 36 hatással volt a DnaI-77ORF104 kölcsönhatásra • 11 igen hatásosan gátolta a bakteriális növekedést

17. Összefoglalás • DnaI és DnaN • Sok potenciális target a DNS replikációs folyamatban • Antimikrobiális hatású fág ORF-ek azonosítása • További, DnaI-hez hasonló proteinek azonosítása • Screening: fág ORF-fel bakteriális target azonosítása • Kis molekulájú inhibítorok • További patogének vizsgálata: - Streptococcus pneumoniae - Pseudomonas aeruginosa

18. Köszönöm a figyelmet!