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ENZIMI DI RESTRIZIONE

ENZIMI DI RESTRIZIONE. Reazione ligasica di frammenti di restrizione. DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONO UNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA’ DI ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNA LIGASI. CLONAGGIO

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ENZIMI DI RESTRIZIONE

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Presentation Transcript

  1. ENZIMI DI RESTRIZIONE

  2. Reazione ligasica di frammenti di restrizione

  3. DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONO UNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA’ DI ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNA LIGASI CLONAGGIO -IN BIOLOGIA CLONARE UN ORGANISMO SIGNIFICA OTTENERE UN INDIVIDUO UNA POPOLAZIONE DI ORGANISMI CHE SONO GENETICAMENTE IDENTICI -IN BIOLOGIA MOLECOLARE CLONARE UN TRATTO DI DNA SIGNIFICA OTTENERE UNA POPOLAZIONE DI DNA IDENTICHE ALLA MOLECOLA DI PARTENZA

  4. Vettori e clonaggio Vettori Plasmidi Fagi Cosmidi YAC

  5. Vettori e clonaggio Plasmide Molecola circolare di DNA a doppio filamento, normalmente presente nella cellula batterica, in grado di replicarsi autonomamente dal cromosoma.

  6. VETTORI DI CLONAGGIO

  7. Bromo-chloro-indoyl--galactopyranosidase or X-Gal (Clear) -galactosidase Bromo-chloro-indoyl (Deep blue insoluble) + galactose

  8. Bacteria from ligation platedon ampicillin and X-Gal Contains wild type plasmd Contains recombinant plasmd

  9. Vettori e clonaggio Lunghezza massima del DNA clonabile in un plasmide: circa 20 Kb

  10. Vettori e clonaggio I virus sono piccoli parassiti non in grado di replicarsi. Dopo aver infettato una cellula-ospite utilizzano i suoi sistemi di replicazione e sintesi delle proteine per riprodursi

  11. Vettori e clonaggio I batteriofagi (o fagi) sono virus che infettano i batteri.

  12. Vettori e clonaggio Il fago più utilizzato in biologia molecolare è il fago 

  13. Vettori e clonaggio Assemblaggio di un fago 

  14. Vettori e clonaggio Mappa del genoma del fago 

  15. Vettori e clonaggio Clonaggio di frammenti di DNA nel fago 

  16. Vettori e clonaggio Formazione di cloni fagici

  17. Vettori e clonaggio L’infezione dei batteri con il fago  è circa 103 volte più efficiente della trasformazione con un plasmide

  18. Vettori e clonaggio Lunghezza del DNA clonabile in un fago: 20-25 Kb

  19. Vettori e clonaggio Un cosmide è un plasmide contenente la sequenza COS dal fago 

  20. Vettori e clonaggio

  21. Vettori e clonaggio Clonaggio di frammenti di DNA in un cosmide

  22. Vettori e clonaggio Lunghezza del DNA clonabile in un cosmide: circa 45 Kb

  23. EcoR I Infect cells Genomic Library

  24. AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA cDNA synthesis AAAAAA AAAAAA Infect cells cDNA library

  25. Genomic Library Construction • Preparing the insert • Partial digestion preferred

  26. Purpose Probe Source Type Variation Representation Insert size Genomic DNA Species or strains Equal 12k -- 20k DNA Gene structure Infer protein identity Only one Encoded protein Infer protein identity Correlate with expression level Species or strains Tissues Developmental stages Expression vs. non expression mRNA DNA or antibody or protein 0.2k -- 6k Genomic library cDNA library

  27. Screening with DNA probe • Probe is identified cloned • From other organism • Same organism • Looking for variants • Chromosome walk Chromosome walk

  28. Genome Projects • Whole genome sequencing • Fragment and clone • Sequence ALL clones! • Computer assembles

  29. Bee Cat Chicken Cow Dog Fruit fly Human Malaria parasite Microbial Genomes Mosquito Mouse Nematode Pig Plant Genomes Central Rat Retroviruses Sea urchin Tribolium Sheep Zebrafish Genome Projects • Multiple organisms provide suitable systems for experimentation • Zebrafish-development • Rat-physiology • Dog- genetic disease • Fruit fly- behavior • Some of practical significance • Mosquito/Malaria parasite

  30. Il metodo Sanger • (o metodo a terminazione di catena) Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica 2) un innesco specifico (primer) 3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S ha bisogno di: 4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza

  31. Terminazione della catena La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegue indefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotidi trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’

  32. Schema di sequenziamento a terminazione di catena 3’-GGCTAAC 3’-GGCTAAC 5’ 3’ DNA stampo a singola elica Ibridazione con Il primer + [35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP -CCG ddA -ddC -CC ddG -CCGA ddT -C ddC -CCGATT ddG -CCGAT ddT A C G T -CCGATT ddG -CCGAT ddT -CCGA ddT -CCG ddA -CC ddG -C ddC -ddC G T T A G C Direzione di lettura C Sequenza: 5’-CCGATTG

  33. Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti Coniugando a ciascun ddNTP un diverso marcatore fluorescente, è possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio e caricare il tutto in solo pozzetto di gel ddA ddT ddC ddG

  34. Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

  35. AGTACTG G GATC Gel Electrophoresis Fluorescent DNA Sequencing

  36. Detection of Fluorescently Tagged DNA Optical Detection System Scanning Laser Excites Fluorescent Dyes Output to Computer DNA Fragments Separated by Electrophoresis

  37. Fluorescent DNA Sequencing Data

  38. Fluorescent DNA Sequence Trace

  39. Size of gene library N = ln(1-P) ln (1-A/B) N = Number of clones P = 95 % probability of finding gene A = Average size of DNA fragments B = Total size of genome E. coli has genome of 4,800,000 nucleotides Average size of insert is 10,000 nucleotides Number of clones for 95 % probability is 1700

  40. Size of gene library • If genome is large e.g. human genome (3 x 109) then number of clones to make library becomes unrealistic (1058000) if using a plasmid vector (accepts only 10 kb as larger DNA can’t be transformed) • Therefore need to use vectors that can accept larger pieces of DNA • I.e. if each vector contains a large piece of DNA you don’t need so many clones to make a gene library

  41. What vectors for what libraries? Human library requires >1,000,000 plasmid clones Human library requires 14000 YAC clones

  42. Vettori e clonaggio YAC=yeast artificial chromosome

  43. Vettori e clonaggio

  44. Vettori e clonaggio Lunghezza del DNA clonabile in uno YAC: fino a 1000 Kb

  45. Vector Type Cloned DNA (kb) Vettori e clonaggio Approximate Maximum Length of DNA That Can Be Cloned in Vectors 20 Plasmid 25 λ phage 45 Cosmid 100 P1 phage 300 BAC (bacterial artificial chromosome) 1000 YAC (yeast artificial chromosome)

  46. Fragment and sequence entire genome Whole Genome Shotgun • Celera Genomics Each fragment is sequenced completely and then these pieces are aligned to one another by a computer, based on overlapping sequence between fragments.

  47. Overview of Facts Asserted • 2.91 billion base pairs (bp) • 1.1% exons, 24% introns, 75% intergenic DNA • 2.1 million single nucleotide polymorphisms (SNP’s) • less than 1% of all SNP’s reflected changes in proteins

  48. Structure of the genome

  49. http://genome.ucsc.edu

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