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肿瘤学

肿瘤学. 300-500 例 /10 万. 1. 细胞凋亡与肿瘤. 胡新荣. 2. 第一节 细胞凋亡的概念和生物学意义. 概念： 是有基因控制的个别细胞发生的主动有序的死亡过程，具有特征性的形态和生化改变。分生理和病理性 凋亡。 生物学意义： 选择性地清除多余、无用、有害细胞、衰老细胞. 3. 第二节 细胞凋亡的形态特征， 光镜下. 凋亡细胞、凋亡小体散在分布。 凋亡细胞：体积缩小，胞浆红染，胞核皱 缩 ， 染色质浓块状。 凋亡小体：球形或椭圆形，红染，为膜包

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  1. 肿瘤学 300-500例/10万 1

  2. 细胞凋亡与肿瘤 胡新荣 2

  3. 第一节 细胞凋亡的概念和生物学意义 概念：是有基因控制的个别细胞发生的主动有序的死亡过程，具有特征性的形态和生化改变。分生理和病理性凋亡。 生物学意义：选择性地清除多余、无用、有害细胞、衰老细胞 3

  4. 第二节 细胞凋亡的形态特征，光镜下 凋亡细胞、凋亡小体散在分布。 凋亡细胞：体积缩小，胞浆红染，胞核皱 缩 ，染色质浓块状。 凋亡小体：球形或椭圆形，红染，为膜包 裹胞质或核碎片。 4

  5. 电镜下 • 细胞表面连接结构消失，光滑轮廓 • 细胞皱缩，胞质中细胞器集中；胞膜出芽或气泡；细胞器保持完整性 • 核改变：核质固缩坚实；边集；核膜皱折 5

  6. 细胞凋亡与坏死的区别 区别点 细胞凋亡 坏死 原因 生理/病理性 病理性 形态特征： 分布 单个散在 片状 胞膜 完整 不完整 细体 变小 肿胀 核质 浓缩，核膜下 分散絮状 胞器 完整 肿胀破碎 凋亡小体 有 无 6

  7. 凋亡 坏死 周围炎症 无 有 生化特征： 调节 基因调节，主动 无，被动 DNA降解 有规则，早期 不规则， 200bp片段， DNA大片段 梯状特征电泳 涂状电泳 蛋白合成 有 无 7

  8. 第三节 细胞凋亡发生的酶学变化 核酸内切酶：在核小体连接区切割DNA 形成180-200bp片段，核破碎 蛋白酶（Caspases）：消化细胞器蛋白， 使细胞皱缩 谷氨酰胺转移酶：使粘性蛋白交联，网 罗细胞器，形成凋亡小体 8

  9. 第四节 细胞凋亡发生过程中活性氧、钙超载、线粒体损伤的作用一、活性氧 Active Oxygen，Reactive Oxygen Spiecies，ROS 是活泼的氧自由基和具有氧自由基反应性的其他含氧物质的总称，包括：O-2、.OH、O.2、H2O2 。 过量ROS引起凋亡：直接损伤DNA；损伤蛋白，灭活酶；影响转录；攻击细胞膜，影响信号传导和线粒体稳定 9

  10. 二、钙超载 钙超载引起凋亡：钙为第二信使，可活化核酸内切酶，舒展DNA；活化蛋白激酶C，从而使cAMP增加；激活NF-kB。 10

  11. 三、线粒体损伤 线粒体损伤引起凋亡： 通透性升高，析出凋亡启动因子如细胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子（Apaf）和凋亡诱导因子（AIF），从而激活Caspase9 和Caspase3，AIF还直接激活核酸内切酶；改变细胞氧化还原潜能 11

  12. 第五节 凋亡发生的范围及诱导与抑制因素 • 范围：多数正常组织，在胚胎发育和机体成长过程中，细胞分裂和凋亡是平衡的 12

  13. 一、诱导凋亡的因素： • 物理因素：紫外线、高温 • 激素：糖皮质激素 淋巴细胞 • 细胞因子：TNF、Fas/Apo-1 • 免疫因素：T淋巴细胞杀伤 • 细胞毒药物：多种抗癌药 • 微生物：细菌、病毒 13

  14. 二、抑制细胞凋亡的因素 • 细胞因子：Ils、CSF、NGF • 蛋白激酶C（PKC）激活剂：TPA • 微量元素锌：抑制钙激活的核酸内切酶 • 激素：睾丸酮、雌激素 • 其他因素：EBV、苯巴比妥 14

  15. 第六节 细胞凋亡的信号转导 • 细胞凋亡信号转导的环节 • ⑴ 各种触发因子与细胞膜受体结合，触发凋亡反应，第一信号系统 • ⑵ 激活信号传导通路，促进凋亡相关基因的表达 • ⑶ 某些凋亡相关基因的表达激活内切酶等效应分子，促进细胞凋亡 15

  16. 细胞凋亡信号转导系统的特点 • 多样性：多种细胞凋亡信号转导系统 • 偶联性：增殖、分化与凋亡 • 同一性：不同凋亡因素可使用同一凋亡信号转导通路 • 多途径：同一凋亡因素可使用多条凋亡信号转导通路 16

  17. 第七节 细胞凋亡的基因调控 • 促进细胞凋亡基因：野生型p53，腺病毒EIA，细胞表面抗原Fas，c-myc， TGF-b1、bax，TNF • 抑制细胞凋亡基因：突变型p53，bcl-2、pRb、ras、EBV 的BHRF-1 17

  18. 一、P53基因 • 80年代初，癌基因；89年，抑癌基因 • ●野生型p53：被DNA损伤激活，阻G1/S进展，轻者修复，重者凋亡，避免DNA突变；激活bad，诱导凋亡 • ●突变型p53：抑制c-myc界导的凋亡 18

  19. 二、Fas基因 • 细胞膜蛋白，属于肿瘤坏死因子(TNF)受体和神经生长因子(NGF)受体家族 • 抑制肿瘤细胞增殖，诱导凋亡 • Fas需与其配体结合发挥凋亡作用。其天然配体就可能是凋亡信号（包括其抗体） • Apo-1: 也是细胞膜蛋白，具有Fas相似的作用 19

  20. 三、c-myc基因 • 双重作用 • 抑制因子存在（抑癌、低血清、抑周期因子），c-Myc促进细胞凋亡 • 刺激因子存在，c-Myc促进细胞增殖,抑凋亡;与bcl-2协同 20

  21. 四、TGF-b1 抑制肝细胞增殖、促进其凋亡 21

  22. 五、 bcl-2基因 • 抑制细胞凋亡（有选择），延长细胞寿命；成熟和衰老细胞中不表达或低表达 • Bcl-2和bax基因功能相反，即bcl-2抑制凋亡，而bax促进凋亡（诱导细胞色素C释放、激活Caspase) • Bcl-2/bax、bcl-2/xl 抑制凋亡；bcl-2/bcl-xs、bax/bad促进凋亡 22

  23. 六、pRb 野生型pRb抑制凋亡； pRb高表达抑制p53诱导的凋亡；pRb、P107、P130缺乏诱导凋亡。 突变型pRb对凋亡无影响。 23

  24. 24 第七节 细胞凋亡与肿瘤一、凋亡与肿瘤发生发展及转移 • 在肿瘤中细胞凋亡小于增殖 • 细胞凋亡率 约为1%-9.5%，淋巴瘤最高,腺癌次子,肉瘤最低 • 细胞凋亡与肿瘤发生发展及转移都有关 • 在肿瘤细胞中，促进凋亡的基因功能增强，抑制凋亡的基因功能减弱 • 机体免疫反应诱导瘤细胞凋亡的功能不全

  25. 二、细胞凋亡与肿瘤的防治 • 治疗后发生凋亡是肿瘤化疗疗效的标志之一；增加凋亡指数与增生指数的比值已成为新的治疗目标；同时诱导细胞凋亡已成为筛选抗癌药物的新标准。 • 在激癌和促癌阶段诱导细胞凋亡可使癌变逆转 • 化疗、放疗、热疗、免疫治疗都可诱发细胞凋亡 25

  26. 防治举例 放疗：淋巴瘤、腺瘤在照后凋亡增加，故对放疗敏感；肝癌、恶黑在照后凋亡不增加，故对放疗不敏感 化疗：抑增殖促凋亡。顺铂、阿霉素、维甲酸等 免疫治疗：抗FAS/APO-1抗体使淋巴瘤凋亡增加 26

  27. 第八节 细胞凋亡的检测方法 基于三条：细胞膜完整性；DNA断裂；细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸(PS) 27

  28. 一、形态学观察方法（一） • HE染色、光镜观察：圆、核深染、染色质团块状、胞质浓缩、胞膜“出芽” • AO(吖啶橙）染色、荧光显微镜观察： • ⑴活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光 • ⑵凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，膜有“凋亡小体” 28

  29. 形态学（二） • 台盼蓝染色：活或凋亡细胞，其膜完整，细胞不着色；死亡细胞，着蓝色 • 透射电镜： • ⑴细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集、细胞器集中 • ⑵细胞膜起泡和出“芽” • ⑶凋亡小体和凋亡小体被吞噬细胞吞噬 29

  30. 二、DNA凝胶电泳 • 检测原理：凋亡细胞DNA断裂有规律，180~200bpDNA片段；坏死细胞DNA断裂无规律 • 结果判断：活细胞，一条区带；凋亡细胞，梯状条带；坏死细胞，血抹片状连续性条带 • 存在问题：不特征；早期凋亡无DNA断裂；灵敏性差，需106细胞 30

  31. 三、酶联免疫吸附法（ELISA）核小体测定 • 原理：DNA断裂有核小体，核小体由组蛋白和DNA片段构成；抗组蛋白抗体 • 方法简单，操作容易 • 敏感性高，可检测5×102细胞 • 半定量；全定量不精确 31

  32. 四、流式细胞仪定量分析 • 原理：凋亡细胞膜通透性介于正常细胞和坏死细胞之间 • 特点： • ⑴检测细胞数量大，较准确 • ⑵可作许多相关分析 • ⑶可确定凋亡细胞所处细胞周期 32

  33. 1、Hoechs-PI双染色法 • 正常细胞不着色，荧光很浅 • 凋亡细胞主要摄取Hoechs，强蓝色荧光 • 坏死细胞主要摄取PI（碘化丙啶）红色 33

  34. 2、DNA片段原位标记法 • 原理：荧光素、地高辛或生物素标记的DUTP和TdT与凋亡细胞DNA链裂解后3`羟基端结合 • 原位缺口转移：用DNA多聚酶将标记物接到DNA断端 • 原位缺口末端标记技术：用TdT将标记的DUTP接到DNA断端 34

  35. 3、检测细胞膜成分变化的Annexin V联合PI法 • 原理：细胞凋亡早期细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外侧；磷脂结合蛋白V(Annexin)同其有高度结合能力,可作为探针 35

  36. V-PI • 结果判断： • ⑴正常细胞 V、PI 均 低染 • ⑵凋亡细胞 V高染，PI低染 • ⑶坏死细胞 V、PI 均高染 • 应用价值 • ⑴凋亡早期；灵敏，假阳性低；简单省时；结果可靠，是目前最为合理的方法 36

  37. 0、目前治疗肿瘤新设想—诱导凋亡 • 导入野生型p53抑制肿瘤增生；下调突变型p53、bcl-2的活性与表达，减弱其对细胞凋亡的抑制；抑癌基因引入瘤细胞，降低致瘤性，使肿瘤逆转为正常细胞；引入某些细胞因子，抑制肿瘤恶性表型，使细胞丧失致瘤性；应用点突变技术，使异常表达基因失活或修复突变基因；导入药物敏感基因，有助于细胞凋亡 38

  38. 0、凋亡与其他疾病一、细胞凋亡异常增加见于相关疾病0、凋亡与其他疾病一、细胞凋亡异常增加见于相关疾病 • 神经系统退行性病变 • 骨髓发育不良综合征 • 缺血性损伤 心梗、肾小球肾炎 • 肝病变 病毒性和酒精性肝炎 • AIDS 39

  39. 二、细胞凋亡过度减少相关疾病 • 自身免疫性疾病： SLE、GN • 肿瘤：激素依赖性肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和淋巴造血肿瘤 • 各种病毒感染：腺病毒、疱疹病毒 40

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