N eophodne u mnogim naučnim oblastima:

1. ELISA i srodne analize (enzyme linked immuno sorbent assay) Gde se koriste ove metode? • Neophodne u mnogim naučnim oblastima: • imunologiji,endokrinologiji i neuroendokrinologiji, molekularnoj biologiji, virusologiji, farmakologiji, kao i u drugim oblastima istaživanja vezanim za reprodukciju… • koriste za određivanje velikog broja supstanci u uzorcima različitog porekla (krvni serum, mleko, plazma, tkivo...): peptidnih hormona, ne-peptidnih hormona, cikličnih nukleotida, imunoglobulina, lekova, virusnih proteina, enzima.

2. RIA prve u nizu… • zasnivaju se na originalnim zapažanjima Yalowu i Bersona (1953) da male koncentracije antitela na insulin mogu da se detektuju zahvaljujući njihovoj sposobnosti da vezuju radioaktivni insulin (insulin obeležen I-131).

3. Radioimunološka analiza (RIA) je zbog svoje preciznosti našla široku primenu u mnogim zemljama, ali naučnici nisu prestali da rade na iznalaženju još podesnijih metoda koje ne bi zahtevale posebne laboratorije, skupe instrumente i korišćenje radioizotopa. • Otkrićem enzimimunoloških metoda (EIA) za odredjivanje koncentracije supstanci kao što su hormoni, imunoglobulini, lekovi i dr. u tome se donekle i uspelo. Ove metode se zasnivaju na istom principu, samo što je kod RIA antigen obeležen radioizotopima, a kod EIA određenim enzimom.

4. ELISA ELISA RIA van Weemen, BK Clinical Chemistry, 51, 12, 2005.

5. ELISA - princip metode • Osnovna karakteristika metode je“obeležavanje"jedne od komponenti enzimom: • Ag ili • Ab: tzv. primarno Ab (1st Ab) ili sekundarno Ab (2nd Ab) • Aktivnost enzima u kompleksu određuje se na osnovu indikatorske reakcije tog enzima sa određenim supstratom koji se dejstvom enzima transformiše u bojeni produkt. • Postoje kompetitivni tip analize i nekompetitivni sendvič - tip analize koja se najčešće koristi kod određivanja koncentracije proteinskih hormona.

6. Ag+ Ab AgAb + standard ili antigen iz uzorka Ag Ag Ab Ag+ AbAgAb standard iliantigen iz uzorka ELISA - princip metode 1) kompetitivni tip 2) ne-kompetitivni tip "obeležen Ag ili Ab"

7. Metoda je visoko specifična: • zbog mogućnosti primeneuskospecifičnih Ab • posebno prečišćenih stabilnih enzima jednostavne kinetike (alkalna-fosfataza, -D-galaktozidaza, peroksidaza rena) • korišćenja jasno definisanih supstrata i hromogena(supstanci koje daju bojeni produkt, ili produkt koji se karakteriše fluorescencijom, odnosno luminescencijom) • količina nastalog produkta meri se fotometrom, odnosno fluorometrom ili luminometrom • metoda ima veliku osetljivost, lako se primenjuje i ima mogućnost merenja malih koncentracija Ag u biološkom materijalu

8. Kompetitivni tip analize • 1st Ab fiksirano za podlogu • kompetituju Ag (standard ili uzorak) i Ag obeležen enzimom • + supstrat =boja Količina bojenog produkta obrnuto srazmerna količini antigena u standardu, odnosno uzorku (videti grafik standardne krive).

9. Nekompetitivni sendvič-tip analize • 1st Ab fiksirano • dodaje se Ag (standard ili uzorak) • drugi put 1st Ag • 2nd Ab obeleženo enzimom • Količina bojenog produkta srazmerna količini antigena u standardu, odnosno uzorku (videti grafik standardne krive)

10. Nekompetitivni sendvič-tip analize • 1st Ab fiksirano • dodaje se Ag (standard ili uzorak) • 1st Ab obeleženo enzimom

11. FIA Fluorescentno-imunološkeanalize Osnovna karakteristika metode je Ag ili Ab obeleženo supstancom koja fluorescira, npr. Eu Stepen fluorescencije meri se fluorimetrom. Kao i kod ELISA testa postoje kompetitivni i ne-kompetitivni tip analize.

12. DELFIA za progesteron i tiroksin kompetitivni tip analize

13. DELFIA komplet za TSH ne-kompetitivni sendvič tip analize Dva antitela protiv različitih antigenih determinanti na antigenu. Jedno antitelo vezano za čvrstu fazu i za njega se vezuje jedna antigena determinanta molekula TSH, a drugo je obeleženo Eu i ono se vezuje za drugu antigenu determinantu istog molekula. Dodavanjem odgovarajućeg rastvora dolazi do oslobađanja jona Eu i formiranja fluorescentnog signala koji je proporcionalan koncentraciji hormona u standardu, odnosno uzorku.

14. Primer protokola-DELFIA za progesteron

16. Nema problema sa NSB • Nespecifično vezivanje obeležene komponente za čvrstu podlogu minimalno • U mnogim komercijalnim kompletima se ne odredjuje. • Postoje kompleti gde se to radi.

17. Kontrola kvaliteta imuno analiza Antitela – velika specifičnost (unakrsna reakcija) i veliki afinitet prema antigenu Standardi: Antigen standarda i antigen iz uzorka moraju da reaguju identično sa specifičnim antitelima Koncentracijski opseg između najvećeg i najmanjeg standarda mora biti dovoljno širok da obuhvati najveći broj očekivanih koncenracija antigena u uzorku. Odnos između pojedinih standarda kao i odnos između celokupnog koncentracijskog opsega i radnog razblaženja antitela, mora da bude takav da određivanje koncentracije antigena u uzorku bude precizno u svakom delu standardne inhibicione krive

18. Optimizacija analize • Homolog (sve komponente od iste vrste) i heterolog sistem (pr. pacovski LH antigen, govedji anti-LH serum, standard pacovski LH • Radni rastvor Ab vezuje 30 -50 %Ag u odsustvu Ag • Ag koncentracija manja od najmanjeg standarda (zbog osetljivosti) • Radni opseg standardne krive : 15 – 90% od B0 • Puferski sistemi, inertni protein-nosači, aditivi, konzervansi... • Vreme inkubacije, temperatura, zapremina inkubacionog sistema (mikrotitar ploče)

19. S • Kontrola kvaliteta: • Specifičnost-napravi se standardna kriva za datu supstancu i odrediED50 Primer: RIA za estradiol , kros-reakcija estrona na antitelo za estradiol kros-reakcija = • Osetljivost – ona koncentracija standarda gde je B za 10% manje od B0 • Preciznost – izračunavaju se koeficijenti varijacije unutar eseja i izmedju dva eseja • Tačnost – odredjuje se na dva načina - test paralelizma - uzorak + ED50 (estradiola) x 100 ED50 (estrona)

21. ELISA -Kompetitivni tip analize za cAMP

22. ELISA -Kompetitivni tip analize za cAMP

23. Biohemija Acetilholinesteraze

24. Acetilacijaipriprema uzoraka

25. Preračunavanje preko standardne krive

26. AgAb AgAb S Preračunavanje preko standardne krive S apsorbanca S

27. Osnovni pojmovi koje treba da znamo: B – količina Ag* koji je formirao kompleks sa Ab T– ukupna količina Ag*i predstavlja B+F B0 – maksimalno vezivanje Ag*za Abu odsustvu neobeleženog Ag NSB-nespecifično vezivanje • Prisustvo neobeleženog antigena inhibira formiranje obeleženog kompleksa. Stepen inhibicije je srazmeran količini neobeleženog antigena. • Da bi odredili nepoznatu koncentraciju Ag, stepen kompetitivne inhibicije u nepoznatom uzorku poredimo sa stepenom kompetitivne inhibicije standarda. • Izražava se najčešće odnosom: B/B0

28. Modeli standardne krive Y Logit-ln model: x-osa S y-osa odgovor (Y) S Y logyt Y = ln 100 - Y B - NSB Y = x 100 B0 - NSB logyt Y = a + b lnX 1 b Y X = e 100 - Y Mogućnost očitavanja sa standardne krive zasniva se na POSTOJANJUPARALELIZMA izmedju standardne krive i inhibicione krive uzorka. Paralelizam postoji ukoliko antigen-standard i antigen iz uzorka pokazuju istovetno ponašanje u odnosu na vezivanje za antitelo. a - b