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酵母菌内 烃类合成途径的构建

酵母菌内 烃类合成途径的构建. 报告人：张文倩. 背景. 目标：实现以 C11 ， C12 为主要成分的中链烃类（ C8-C14 ）的生物合成. 脂酰 CoA. 葡萄糖. 脂酰 CoA 水解酶（ 硫酯酶） C8-16. （人，小鼠）. 自由脂肪酸. 丙酮酸. α- 双加氧酶 C10-16. （大米）. 乙酰辅酶 A. 脂肪醛. 脂肪醛脱羰酶 C14-18. （蓝细菌）. ACC. 丙二酰辅酶 A. 烷烃. 脂酰 CoA 硫酯酶.

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酵母菌内 烃类合成途径的构建

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Presentation Transcript

  1. 酵母菌内烃类合成途径的构建 报告人：张文倩

  2. 背景 目标：实现以C11，C12为主要成分的中链烃类（C8-C14）的生物合成

  3. 脂酰CoA 葡萄糖 脂酰CoA水解酶（硫酯酶） C8-16 （人，小鼠） 自由脂肪酸 丙酮酸 α-双加氧酶 C10-16 （大米） 乙酰辅酶A 脂肪醛 脂肪醛脱羰酶C14-18 （蓝细菌） ACC 丙二酰辅酶A 烷烃

  4. 脂酰CoA硫酯酶 选取小鼠和人各一个基因命名为H1，H2，已经合成回来，连接在pUC18上。现H2已经连接到pYES2.0上。正在进行酵母转化

  5. α-双加氧酶 -

  6. 十五醛 C10-C16脂肪酸 十三醛 十一醛 C9-C 15脂肪醛 壬醛 Assumption: α-dioxygenase only accepts long- and middle-chain fatty acids with a carbon chain of at least ten carbon atoms as substrates

  7. 脂肪醛脱羰酶 ORF1594 蓝细菌中产烃体系 PCC7942中的ORF 1594 和ORF 1593 ORF 1593

  8. C14-C18醛 Require O2 Require a reducing system： NADPH and ferredoxin and ferredoxinreductase C13-C17烃

  9. 基础工作:基因的连接导入 脂酰CoA 脂酰CoA水解酶 H1, H2 自由脂肪酸 • HI,H2, 导入pYES2.0（含诱导性启动子GAL1），在酵母中进行单表达 • 合成α-DOX（设计酶切位点） • 将α-DOX 和R2分别导入pYES2.0 ，分别采用不同强度的组合型启动子进行组合优化，进行单表达 启动子强度：TEF1>TDH3>PGK1>TDH1 • 将三个基因一起连接到同一pYES2.0上，实现共表达（均选取表达效果较好的启动子） α-DOX α-双加氧酶 脂肪醛 R2 脂肪醛脱羰酶 中链烃（Jet Fuel） C7-15；C11

  10. 工作方向 1 体内外检测酶活的方法 体内：将单个基因HI,H2 ,α-DOX ,R2分别导入pYES2.0，在酿酒酵母中进行单表达，酶利用细胞自身的底物生成对应产物，通过检测产物含量验证酶活。（色谱） 体外：需根据具体反应所需的条件（如是否需氧，是否需要还原体系等）构建酶活反应体系，进而提供相应底物，通过产物含量检测酶活。

  11. 2 内源ACC启动子替换具体方案 已经要到PWJ1042质粒，可以进行URA3的同源臂替换，最终将ACC的原有启动子替换为其他强度较大的启动子如TEF1。

  12. 3耶氏解脂酵母相关资料的查阅（索要整合型与游离型质粒，可用启动子）3耶氏解脂酵母相关资料的查阅（索要整合型与游离型质粒，可用启动子） 4着丝粒质粒（比普通游离型质粒稳定，拷贝数低） 目前有三种营养标记型。 将基因导入着丝粒质粒中，试验其表达效果

  13. Thank you!

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