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2. Sterilisation und Keimreduktion

2. Sterilisation und Keimreduktion. 2.2. Abtötung durch trockene Hitze. 2.2.2. Ausglühen und Abflammen mit Bunsenbrenner. 2. Sterilisation und Keimreduktion. 2.2. Abtötung durch trockene Hitze.

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2. Sterilisation und Keimreduktion

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Presentation Transcript

  1. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.2. Abtötung durch trockene Hitze 2.2.2. Ausglühen und Abflammen • mit Bunsenbrenner

  2. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.2. Abtötung durch trockene Hitze • Bunsenbrenner so einstellen (Luft), dass eine nichtleuchtende, hellblaue Flamme im Innenkegel und eine helle, orange-gelbe Flamme im Außenkegel entsteht • Innenkegel mit ca. 300 °C: stark reduzierende Bedingungen am Übergang zum Außenkegel • Außenkegel mit bis zu 1500 °C: stark oxidierende Bedingungen an der Spitze

  3. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.2. Abtötung durch trockene Hitze • Ausglühen • für Impfnadeln, Impfösen, Klingen, Scheren, Präpariernadeln, Pinzetten, … • diese werden durch den äußeren Teil des Flammenkegels gezogen bis sie glühen • Temp. von ca. 1000 °C • Mikroorganismen werden innerhalb von Sekundenbruchteilen getötet – steril • Material leidet, Klingen verlieren Schärfe

  4. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.2. Abtötung durch trockene Hitze • Abflammen • für Metall-, Porzellan-, Glasgeräte (z.B. Drigalski-Spatel) • oberflächliche Sterilisation • Gegenstand wird durch die Flamme gezogen, ohne ihn zum Glühen zu bringen • tw. unter Zuhilfenahme von 96%igem EtOH: Eintauchen + Abflammen (Spatel) • früher weit verbreitet, heute eher Notbehelf

  5. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.3. Chemische Sterilisation und Desinfektion • Sterilisation durch Gase: Ethylenoxid • für hitzeempfindliche Produkte • sehr giftig, explosionsgefährlich • nicht immer rückstandsfrei (Filter) • im Labor nicht/selten verwendet • Desinfektion durch chemische Mittel • Desinfektionsmittel genannt • für Oberflächen: Medizin gegen Krankheitserreger, Labor/Industrie möglichst breit gegen alle Keime • Keimreduktion um 5 Zehnerpotenzen angestrebt (99,999%)

  6. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.3. Chemische Sterilisation und Desinfektion • Fertigprodukte (optimiert für ein bestimmtes Einsatzgebiet): z.B. Sterilium, … • 70%iger EtOH (Verdünnung 96% EtOH) • Kontrolle z.B. Filterplättchentest • Wirksamkeit abhängig von: • Schmutz-, Fett-, anderen Begleitstoffen • pH-Wert • Temperatur • Ausgangskeimzahl

  7. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.3. Chemische Sterilisation und Desinfektion • Händedesinfektion • Waschen mit Seife reduziert Keimzahl um 60 bis 80 Prozent • Desinfektion zumeist auf Alkoholbasis • 70% Ethanol (nicht 96%) • 70% 2-Propanol • 60% 1-Propanol (n-Propanol) • Fertigdesinfektionsmittelgemisch: „Sterilium“ • am schnellsten keimtötende Verbindungen: vegetative Zellen bereits nach 30 bis 60 sek abgetötet • Wirkung 1 bis 2 Stunden

  8. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.3. Chemische Sterilisation und Desinfektion • Anleitung

  9. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.4. Bestrahlung • nur mit energiereicher, ionisierender Strahlung möglich (dringt tief genug ein) • Gammastrahlung z.B. für medizinische Artikel (Spritzen, Kanülen, Katheter, Verbandmaterial), aber auch in der pharmazeutischen Industrie für z.B. Verpackungsmaterialien • in der mikrobiologischen Praxis nur UV-Bestrahlung relevant: • meist zur Verminderung der Keimzahl in Raumluft und an Oberflächen eingesetzt

  10. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.4. Bestrahlung • für Werkbänke, Arbeitsflächen, Laminar-Flows • v.a. UV-C Strahlung eingesetzt (200-280 nm) • Optimum bei ca. 260 nm, da Nukleinsäuren in diesem Bereich absorbieren – strukturelle Veränderungen der DNA (kovalenter Ringschluss zw. Pyrimidin-Basen) und Replikationsfehler (Zelltod) • Beim Einsatz von UV-Strahlung zur Desinfektion muss auf Staubfreiheit geachtet werden

  11. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.5. Sterilfiltration • zur Entkeimung thermolabiler Substanzen (z.B. Antibiotikalsgen, Vitaminlsgen, …) und Gasen • für Entfernung von Partikeln in Lsgen • Entgasen von Lsgen • mittels Oberflächenfiltern: • aus Cellulose, Celluloseestern, Kunststoff (PTFE (Polytetrafluorethylen), Teflon, …) • dünne Membranen • regelmäßige Poren mit gleichmäßigem Durchmesser (v.a. 0,2 µm und 0,45 µm eingesetzt) • wirken wie ein Sieb und halten die Partikel an der Oberfläche • kaum Wirkung gegen Viren, dünne Bakterienzellen, DNA • hohe Durchflussleistung • leicht verstopft

  12. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.5. Sterilfiltration • mittels Tiefenfiltern: • entweder aus feinen Fasern (Cellulose-, Keramik-, Kunststofffasern), die regellos miteinander verbunden sind • oder aus körnigem, meist gesintertem Material (Kieselgur, Keramik, Glassinter) • dick geschichtet (bis in Meterbereich) • labyrinthartiges Hohlraumsystem • kein einheitlicher Porendurchmesser • Partikel v.a. in der Tiefe des Filters zurückgehalten: • mechanisch, • Adsorption, • elektrostatische Kräfte • auch Partikel, die kleiner sind als der Porendurchmesser, können zurückgehalten werden • geringe Durchflussraten (ca. 40 mal geringer als bei Oberflächenfiltern) • Hallenbäder

  13. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.5. Sterilfiltration • Sterilfiltration von Flüssigkeiten (Oberflächenfilter): • im Labor meist mit sterilen 0,2 µm Membranfiltern aus hydrophilem Material (v.a. Cellulosenitrat, Celluloseacetat) • Verwendung von größer-porigen Vor-Filtern • „Auswaschen“ von verschiedenen Stoffen aus dem Filtermaterial möglich: z.B. bei Nitratbestimmung keine Cellulosenitrat-Filter verwenden • Filtrationsgeräte (Filterhalter, Schläuche, Gefäße) werden separat (dampf)sterilisiert

  14. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.5. Sterilfiltration • Durchführung: • meist wird im Auffanggefäß ein Unterdruck erzeugt (Vakuumpumpe), die aufgesetzte, sterile Filtereinheit mit der Flüssigkeit beschickt und letztere durch den Unterdruck über einen Membranfilter in das Auffanggefäß gesaugt • Aufsetzen der Filtriereinheit muss unter aseptischen Bedingungen erfolgen • Verschluss ebenfalls unter aseptischen Bedingungen • ODER: sterile Fertigfilter mit 0,2 µm Porendurchmesser für kleine Volumina

  15. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.5. Sterilfiltration • Filtriereinheit

  16. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.5. Sterilfiltration • Filtriereinheit

  17. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.5. Sterilfiltration • Sterilfiltration von Gasen: • Tiefenfilter • im Labor für Belüftung oder Begasung von Kulturen notwendig • für Kleinfermenter • meist Watte- oder Glaswollefilter • ein Glasgefäß, -röhrchen o.Ä. wird mit Watte/Glaswolle (bis 6 µm Faserdurchmesser) gleichmäßig und fest gestopft • Material sollte hydrophob sein (wenig Flüssigkeitsaufnahme (z.B. Aquarienwatte)) • Durchmesser 1 bis 3 cm, Länge 5 bis 20 cm, je nach Verwendung • Länge abhängig vom beabsichtigten Durchfluss • gestopfte Filter autoklavieren

  18. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.5. Sterilfiltration Gase:

  19. 3. Steriles Arbeiten • Ziele: • Sterile Nährböden, Lösungen und Geräte vor Kontamination schützen • Reinkulturen „rein“ halten • die Umwelt (Raum, Personen,...) vor Infektionen durch Versuchsorganismen schützen • Hauptkontaminationsfaktoren: • Luft • viele Organismen sind luftgetragen (Sporen) • „normale“ Raumluft mit bis zu 2000 (2 x 103) Keimen (zumeist an/auf Staubpartikeln) • Mensch (Hände, Haare,…) • Staub • „Tröpfcheninfektion“ • unsteriles Arbeitsgerät • Öffnen von sterilem Material (sterile Spitzen) etc. in unsteriler Umgebung

  20. 3. Steriles Arbeiten • 4 Risikogruppen für den Umgang mit pathogenen Mikroorganismen: • Risikogruppe 1: kein Risiko (oder sehr geringes) Risiko für (gesunde) Menschen und Wirbeltiere • Risikogruppe 2: geringes (bis mäßiges) Risiko für Menschen und Wirbeltiere. Potentielle Krankheitserreger, die aber wirksam behandelt werden können • Risikogruppe 3: mäßiges bis hohes Risiko, Erreger schwerer Krankheiten beim Menschen, Behandlung normalerweise möglich • Risikogruppe 4: hohes Risiko für den Menschen, Behandlung oft schwierig

  21. 3. Steriles Arbeiten • 4 Risikogruppen - Beispiele: • Gruppe 1: Bacillus subtilis, E. coli K12 (Laborstamm), Lactobacillus casei, Micrococcus luteus; Aspergillus niger, Geotrichum candidum, Penicillium chrysogenum • Gruppe 2: Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, E. coli; Aspergillus flavus, Candida albicans, Aspergillus fumigatus • Gruppe 3: Bacillus anthracis, E. coli (EHEC-Stämme), Yersinia pestis; Histoplasma capsulatum var. capsulatum • Gruppe 4: bestimmte Viren • Mit Organismen der Risikogruppen 2 bis 4 darf nur in genehmigten und dafür eingerichteten Labors gearbeitet werden

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