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Fibrosis Cística

Química Biológica Patológica. Fibrosis Cística. Técnicas Moleculares de Diagnóstico. Tema:18 (3).  Dra. Silvia Varas qbpatologica.unsl@gmail.com. R-domain. CFTR para ser funcional debe recibir 2 señales reguladoras: 1- Fosforilación de su dominio R por una PK

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Fibrosis Cística

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Presentation Transcript

  1. Química Biológica Patológica Fibrosis Cística Técnicas Moleculares de Diagnóstico Tema:18 (3)  Dra. Silvia Varas qbpatologica.unsl@gmail.com

  2. R-domain CFTR para ser funcional debe recibir 2 señales reguladoras: 1- Fosforilación de su dominio R por una PK 2-La asociación e hidrolisis de 2 moleculas de ATP out in 2° N ATP ATP 1°- PK activada AMPc C Familia Transportadores ABC: ABC C7

  3. R-domain CFTR para ser funcional debe recibir 2 señales reguladoras: 1- Fosforilación de su dominio R por una PK 2-La asociación e hidrolisis de 2 moleculas de ATP Cl- out in N ADP ADP C

  4. MUTACIONES • Se han identificado mas de 1300 mutaciones en el gen CFTR (www.genet.sickkids.on.ca/cftr): • Mutaciones con cambio de sentido: 40% • Mutaciones sin sentido: 18% • Mutaciones en los sitios de splicing: 18% • Mutación en el marco de lectura: 22% • Otras mutaciones: 2%

  8. Mutaciones en CFTR: Frecuencia en USA Se han descripto más de 1300 mutaciones ΔF508 es cerca del 70% de los casos descriptos de FC.

  9. Frecuencias en Argentina • F-508 - 57 % • G542X - 3,94% • W1282X - 3,07% • N1303K - 1,75% • 1717 1GA - 0,87% • R553X - 0,43% • R1162X - 0,43%

  10. Pesquisa Neonatal de FQ en la Argentina • Pesquisa Neonatal de FC desde 1994 (Ley Nacional 24.438-94 y 26.279-07) las estrategias mas usadas son: TIR/TIR y TIR/TIR/ADN. • Cobertura Nacional : 15-20% RN • Incidencia 1:6.131

  11. Frecuencia Mutaciones 1º- F508 está presente en el 58-60% 2º- G542X 5% 3º- 16 mutaciones (N1303K, W1282X, 1717-1G>A, 3849+10KbC>T, R334W, G85E, DI507, 2183AA>G, 2789+5G>A, 1811+1.6Kb A>G, R1162X, R553X, R1066C, 621+1G-T, 3659delC y 1898+1G>A) en 1-2 %

  12. Estrategias de Laboratorio Molecular I • PCR + Digestión con Enzima de Restricción • PCR con primer modificados + Digestión con Enzima de Restricción • PCR con primers alelo específicos (PCR alelo especifica): 1 Fragmento • Multiplex alelo especifica (MAS): 2 o mas fragmentos

  13. Estrategias de Laboratorio Molecular II • La estrategia para realizar un diagnóstico molecular se elabora en función de la heterogeneidad alélica de cada población Esta estrategia se inicia con el análisis de las mutaciones más frecuentes. • Si una o ambas mutaciones no se identifican es necesario realizar un rastreo del gen CFTR, mediante técnicas que permitan detectar cualquier cambio existente en la secuencia del DNA de la muestra. Las técnicas más comúnmente utilizadas en el análisis del gen CFTR son la electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante (DGGE) y el análisis de la conformación de la cadena sencilla (SCCA) Las dos técnicas han mostrado una alta sensibilidad (>98%) para la detección de fragmentos anómalos.

  14. Estrategias: • F-508 - 57% • G542X - 3.94% Mut.med. por PCR • W1282X - 3.07% E.R • N1303K - 1.75% Mut.med. por PCR • 1717 1GA - 0.87% Mut.med.por PCR • R553X - 0.43% E.R • G551D - 0.43% E.R

  15. Estrategias para caracterización de mutaciones en FC: 1- PCR-RFLP (amplification + endonuclease restriction) 2- Mutagénesis Dirigida (Mutation mediated for PCR + Amplification + endonuclease restriction)

  16. 1- PCR-RFLP (amplification + endonuclease restriction)

  17. M 1 2 3 - 300 pb 420pb 720 pb PCR+RFLP (amplification+ endonuclease restriction) Alelo Normal Alelo Mutado

  18. Detección F508 MétodoMutagénesis mediada por PCR

  19. Nomenclatura Hebras de ADN ! Cadena Codificante, Informativa, sens o cadena (+) Secuencia publicada en Gene Bank! 5’ 3’ 3’ 5’ Cadena Molde, no-codificante, no-informativa, antisentido (anti sens) o cadena (-)

  20. Human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene, exon 10. • ORIGIN 1 cactgtagct gtactacctt ccatctcctc aacctattcc aactatctga atcatgtgcc 61 cttctctgtg aacctctatc ataatacttg tcacactgta ttgtaattgt ctcttttact 121 ttcccttgta tcttttgtgc atagcagagt acctgaaaca ggaagtattt taaatatttt 181 gaatcaaatg agttaataga atctttacaa ataagaatat acacttctgc ttaggatgat 241 aattggaggc aagtgaatcc tgagcgtgat ttgataatga cctaataatg atgggtttta 301 tttccagact tcacttctaa tgatgattat gggagaactg gagccttcag agggtaaaat 361 taagcacagt ggaagaattt cattctgttc tcagttttcc tggattatgc ctggcaccat 421 taaagaaaat atcatctttg gtgtttccta tgatgaatat agatacagaa gcgtcatcaa 481 agcatgccaa ctagaagagg taagaaacta tgtgaaaact ttttgattat gcatatgaac 541 ccttcacact acccaaatta tatatttggc tccatattca atcggttagt ctacatatat 601 ttatgtttcc tctatgggta agctactgtg aatggatcaa ttaataaaac acatgaccta 661 tgctttaaga agcttgcaaa cacatgaaat aaatgcaatt tattttttaa ataatgggtt 721 catttgatca caataaatgc attttatgaa atggtgagaa ttttgttcac tcattagtga 781 gacaaacgtc tcaatggtta tttatatggc atgcatatag tgatatgtgg t

  21. Human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene, exon 10. g • ORIGIN 1 cactgtagct gtactacctt ccatctcctc aacctattcc aactatctga atcatgtgcc 61 cttctctgtg aacctctatc ataatacttg tcacactgta ttgtaattgt ctcttttact 121 ttcccttgta tcttttgtgc atagcagagt acctgaaaca ggaagtattt taaatatttt 181 gaatcaaatg agttaataga atctttacaa ataagaatat acacttctgc ttaggatgat 241 aattggaggc aagtgaatcc tgagcgtgat ttgataatga cctaataatg atgggtttta 301 tttccagact tcacttctaa tgatgattat gggagaactg gagccttcag agggtaaaat 361 taagcacagt ggaagaattt cattctgttc tcagttttcc tggattatgc ctggcaccat 421 taaagaaaat atcatctttg gtgtttccta tgatgaatat agatacagaa gcgtcatcaa 481 agcatgccaa ctagaagagg taagaaacta tgtgaaaact ttttgattat gcatatgaac 541 ccttcacact acccaaatta tatatttggc tccatattca atcggttagt ctacatatat 601 ttatgtttcc tctatgggta agctactgtg aatggatcaa ttaataaaac acatgaccta 661 tgctttaaga agcttgcaaa cacatgaaat aaatgcaatt tattttttaa ataatgggtt 721 catttgatca caataaatgc attttatgaa atggtgagaa ttttgttcac tcattagtga 781 gacaaacgtc tcaatggtta tttatatggc atgcatatag tgatatgtgg t

  22. Enzima restricción MboI: 5’- GATC -3’ 3’- CTAG -5’

  23. Secuencia del exón 10 próxima al codón 508 Normal: 5' ACCATTAAAGAAAATATCATCTTTG ΔF508: 5' ACCATTAAAGAAAATATCAT TG Primer S: 5' ACCATTAAAGAAAATATGAT Primer AS: 5' TGCAAGCTTCTTAAAGCATA Productos de amplificación y corte con Mbo I Normal (262 pb) 17 pb ▼201pb▼44 pb 5’ACCATTAAAGAAAATATGATCTT................. AATGGATC........... GCA 3' Mutado (259 pb) 215 pb ▼ 44 pb 5' ACCAATTAAAGAAAATATGATTG.................... AATGGATC............ GC 3'

  24. MboI (-) MboI (-) MboI (-) MboI (-) MboI (-) MboI (+)

  25. FAMILIA 1

  26. FAMILIA 2

  27. Familia 3

  28. Alelo N 201 pb M 100pb Alelo M 215 pb Gel 12% de productos de PCR digeridos con MboI

  29. G542X

  30. Estrategias: F-508 - 57% G542X - 3.94% Mut.med. por PCR W1282X - 3.07%E.R N1303K - 1.75% Mut.med. por PCR 1717 1GA - 0.87% Mut.med.por PCR R553X - 0.43%E.R G551D - 0.43%E.R

  31. Modelo de Informe Análisis de Mutaciones en el gen CFTR Metodología: Amplificación por PCR a partir de ADN purificado de leucocitos. Mutagénesis dirigida mediada por PCR,Hibridización con sondas alelo especificas PACIENTE MUTACIONES ANALIZADAS F-508 G542XW1282XN1303K Inocente Gómez -/- -/- -/- -/- Culpable Gómez -/- -/- -/- -/+ Interpretación de los Resultados: +/-: Heterocigota para la mutación -/-: No presenta la mutación +/+: Homocigota para la mutación

  32. PCR multiplex alelo especifica (MAS-PCR): es la amplificación en un único tubo de múltiples fragmentos de un determinado gen. Esta estrategia involucra la elección de los pares de primers que deberán dar lugar a fragmentos de diferente tamaño y que deberán ser fácilmente resueltos en una única línea de un gel. Los primers usados son alelo-específicos. Esta técnica se ha usado con éxito en el diagnostico de enfermedades como la distrofia muscular de Duchenne, Lesch-Nyhan, -talasemia y screenning de 4 de las comunes mutaciones para fibrosis cística (F508, G542X, G551D y N1303K).

  33. F-508 CF-W1468-N     CF-508 RP N:139 pb M: 136 pb

  34. 5’IVS-11   t   G542X-M G542X-N N y M:174 pb

  35. 5’IVS-11   a   G551D-M G551D-N N y M:202 pb

  36. 5’IVS-11   t   R553X-M R553X-N N y M:207 pb

  37. 5’IVS-21   g   N1303K-N N1303K-M N y M:240 pb

  38. Master 1 (Normal): F1 +R1 F3 + R2 F3 + R4 F4 + R6 Total: 7primers Master 2 (Mutadas): F2 + R1 F508 F3 + R3 G551D F3 + R5 G543X F4 + R7 N1303K Total: 7primers Constituyentes Master Mix

  39. N M N M N M N M N M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Los tamaños de los productos de amplificación son: N1303K (240pb), G551D (202pb), G542X (174pb) y F508 (136pb), WT (139).

  40. En los extremos Marquer de Peso Molecular (X174 digerido con Hae III). En las líneas 2,4, 6, 8 y 10 se usan los primers con las secuencias normales. • Líneas 1 y 2: Paciente 1 con primers N y M • Líneas 3 y 4: Paciente 2 con primers N y M • Líneas 5 y 6: Paciente 3 con primers N y M • Líneas 7 y 8: Paciente 4 con primers N y M • Líneas 9 y 10: Paciente 5 con primers N y M • Basado en los datos brindados por esta publicación, realice el informe de las mutaciones analizadas de los pacientes 1 al 5.

  41. TP: F508 y G542X

  42. F-508 CF-W1468-N     CF-508 RP N:139 pb M: 136 pb

  43. 5’IVS-11   t   G542X-M G542X-N N y M:174 pb

  44. P1 P2 P3 P4 P5 P6 N M N M N M N M N M N M Los tamaños de los productos de amplificación son: G542X N y M (174pb) y F508 (136pb), WT (139).

  45. Modelo de Informe Análisis de Mutaciones en el gen CFTR Metodología: Amplificación por PCR a partir de ADN purificado de leucocitos. Mutagénesis dirigida mediada por PCR,Hibridización con sondas alelo especificas PACIENTE MUTACIONES ANALIZADAS F-508 G542XW1282XN1303K Inocente Gómez -/- -/- -/- -/- Culpable Gómez -/- -/- -/- -/+ Interpretación de los Resultados: +/-: Heterocigota para la mutación -/-: No presenta la mutación +/+: Homocigota para la mutación

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