不连续系统聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳

实验题目 不连续系统聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳

实验目的 • 掌握电泳分离纯化蛋白质的方法与原理

聚丙烯酰胺凝胶系统简介 聚丙烯酰胺凝胶缓冲系统

聚丙烯酰胺凝胶简介 凝胶组成成份：丙烯酰胺单体甲叉双丙烯酰胺催化剂（过硫酸铵）加速剂 (四甲基已二胺 TEMED）。聚合交联起来，形成三维网状结构的凝胶。

凝胶浓度的选择 • 分离蛋白质或核等大分子混合的关键: 选择一定孔径的凝胶 • 凝胶的孔径:丙烯酸和甲叉双丙烯酰胺总浓度（T％）的控制, T％越大，孔径越小 • 根据所要分离的蛋白质的分子量大小选择适当的凝胶浓度 • 常用的标准凝胶是指浓度为7.5％，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能得到满意的结果

缓冲系统的选择 • 适当的缓冲浓系统: 是电泳的关键问题，特别要注意PH范围及离子。 • 电泳所选择的PH应能使蛋白质分子处于较大电荷状态， • 因此PH要远离蛋白质的等电点，使蛋白质分子中羧基或氨基的解离度尽量增大 • 但要避免由于缓冲度PH过高或过低而损害样品的稳定性，离子强度通常选用0.01～0.1M

不连续性表现 凝胶的选泽： 1.分离胶 2.浓缩胶缓冲液的选择； 1.样品及浓缩胶中缓冲液： pH6.7 Tris—HCl缓冲液。 2.电极槽缓冲液： pH8.3 Tris一甘氨酸缓冲

上槽电极缓冲液， pH8.3 Tris一甘氨酸 样品， pH6.7 Tris—HCI 浓缩胶分离胶 pH8.3 Tris一甘氨酸实验原理

（一）浓缩效应： 浓缩胶系统中含有大小不同的离子为： Cl—、 Pr—（蛋白质离子）、 H2N—CH2COO—（甘氨酸离子）。 pH6.7缓冲液中 HCl几乎全部解离为Cl－，甘氨酸等电点接近6.7，有少量甘氨酸分子解离，而血清蛋白质的等电点一般为pH5左右，其解离度在HCl和甘氨酸之间。电泳系统通电后：这三种离子泳动效率是 Cl-＞Pr－＞ H2NCH2COO—

（二）电荷效应 • 蛋白质混合物在界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度蛋白区 • 但由于每种蛋白质分子所载有电荷不面，泳动率不同。 • 通过此种电荷故应，各种蛋白质以一定的顺序排列成一个一个的园盘状。

（三）分子筛效应 • 蛋白质分子在电场作用下泳动时，受到两种力的影响，即静电引力和介质阻力的作用。 • 分子大小或构象不同的蛋白质，通过一定孔径的分离胶时，所受摩擦力不同，受阻滞的程度不同，此也表现出不同的迁移率。 • 即使蛋白质所带的净电荷相似；也由干分子筛效应而在分离胶中被分离开来。

实验操作 2.样品配制： 1.凝胶柱的制备 3、电泳： 4．染色与脱色

7.5cm处画线（浓缩胶） 7cm处画线（分离胶） 1.凝胶柱的制备如图画线

分离胶溶液的配制 • 按上表配制分离胶，用胶头滴管沿管壁缓慢 • 加入到 7cm划线处。如有气泡设法排除 (2) 随即用胶头滴管沿凝胶管壁缓慢加入蒸馏水约3-4滴，注意防止胶液表面的震动与扩散。 • 静止约20-30分钟，在凝胶表面与水之间出 • 现渐清的界面，表示聚合已完成，用滤纸条轻 • 轻吸会凝胶表面水份，注意不能损伤已聚合的 • 凝胶表面。

浓缩胶溶液的配制 （1）按上表配制浓缩胶，立即用胶头滴管将其加至玻璃管中分离胶上至7.5cm划线平面，（2）随即用胶头滴管沿凝胶管壁缓慢加入蒸馏水3-4滴，注意防止胶液表面的震动与扩散。（3）放置约20-30分钟左右，用滤纸轻轻吸除水份待用。

2.样品配制： 正常人血清0.3ml，加入样品稀释液1.7ml，内含溴酚兰0．005％为示踪染料。

3．电泳： ①安装凝胶柱：将制备好的凝胶管插入上电泳槽的橡胶塞孔中 ②加缓冲液：下电泳槽中加入电极缓冲液，放上上电泳槽，再装满电极缓冲液 ③上样：加样器吸取样品，加入1大滴，或2小滴，沿管壁加在浓缩胶面上。

④ 接通电流： 电流为 l mA／管，10分钟后，调节电流为4mA／管。待示踪染料迁移到管下端时，切断电源（电泳时间约2．5小时）。 ⑤剥离凝胶：取下凝胶管，用注射器盛蒸馏水，沿管壁插入管内，边插入边注水，然后用吸耳球轻轻在胶管的一端加压，使凝胶柱从管中慢慢滑出，装入到细试管中。

4．染色与脱色 ①将凝胶柱置于小试管中，加入染色液， 60℃中染色18-20分钟。 ②倒出染色液，换以脱色液， 60℃中脱色30～60分钟。

实验结果 • 根据染色后观察的条带。在报告上画图。实验讨论 • 分离纯化蛋白质的方法有哪些？各自的原理

注意事项 • 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经性毒剂，对皮肤有刺激作用，应避免直接接触。 • 电泳完毕后，上下槽电泳缓冲液不能混，因离子强度PH都已发生改变。

不连续系统 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳