Vēža veidošanās molekulārie mehānismi Vēzis – šūnu līmenī ģenētiska slimība Vēža genoma izpēte

1. Vēža veidošanās molekulārie mehānismi • Vēzis – šūnu līmenī ģenētiska slimība • Vēža genoma izpēte • Vēža šūnu fizioloģiskās īpašības • Vēža šūnu heterogenitāte un cilmes šūnas • Iedzimta vēža predispozīcija • Molekulārie testi Dr. Aija Linē, BMC

2. Vēža pētniecības virzieni Fundamentālie Translācijas Klīniskie pētījumi Genoms & epigenoms Testu izstrāde Signālceļu izpēte Zāļu vielu dizains Starpšūnu mijiedarbības Biomarķieru atklāšana Jaunas terapijas stratēģijas Zāļu un biomarķieru klīniskie izmēģinājumi Molekulārie mehānismi Jaunu zāļu mērķu izpēte Zāļu testēšana Mērķis: prevencija, labāka diagnostika, efektīvāka ārstēšana un pacientu dzīves kvalitātes uzlabošana

3. Vēzis ir otrs biežākais priekšlaicīgas nāves cēlonis - katrs trešais savas dzīves laikā ar to saslimst, katrs piektais – no tā mirst. Ik gadu pasaulē > 10 miljoni cilvēku saslimst un >7.6 miljoni mirst ar vēzi

4. Saslimstība un mirstība no dažādiem vēža veidiem vīriešiem Eiropā un Latvijā (2012. gadā) Eiropā Latvijā

5. Saslimstība un mirstība no dažādiem vēža veidiem sievietēm Eiropā un Latvijā (2012. gadā) Eiropā Latvijā

6. Šūnu līmenī vēzis ir ģenētiska slimība Vēzis veidojas, somatiskajās šūnās uzkrājoties ģenētiskām un epiģenētiskām izmaiņām, kas tām nodrošina specifiskas fenotipiskas īpašības un selektīvas priekšrocības. Parasti vēža veidošanās procesā ir nepieciešamas izmaiņas vairākos gēnos.

7. Audzēju veidošanos izraisa izmaiņas divu tipu gēnos - onkogēnos un audzēju supresor- gēnos Pašlaik zināmi ~487 gēni, kuros ir atrastas dažāda veida mutācijas un ir funkcionāli iesaistīti vēža veidošanās procesā

8. Onkogēni - Gēni, kuru kodētie proteīni mutāciju rezultātā kļūst konstitutīvi aktīvi vai tiek producēti paaugstinātā daudzumā, un spēj izraisīt šūnu transformāciju vai veicināt audzēja progresiju (parasti - dominanti) Atbilstošais normālais šūnas gēns – proto-onkogēns Funkcionāli tie ir dažādi proteīni – augšanas faktori vai to receptori, apoptozes inhibitori, signālu transdukcijas molekulas u.c.

9. Onkogēnus var aktivēt: • Punktveida mutācijas  hiperaktīvs proteīns (RAS, BRAF) • Gēnu amplifikācija  normāla proteīna pārprodukcija (AKT2, MYC) • Hromosomālastranslokācijas: Paaugstināts ekspresijas līmenis (BCL2) Paaugstināta proteīna aktivitāte (BCR-ABL) • Epiģenētiskas izmaiņas: DNS hipometilēšana (Ciklīns D2, RAS) Hromatīna remodelēšana (CDKN2A) • Dažus onkogēnus pārnes retrovīrusi (HTLV1) • Retrovīrusuinsercijasaimniekšūnas genomā proto-onkogēnu tuvumā  paaugstināta ekspresija (LMO2)

10. Audzēju supresor- gēni Gēni, kuru normālā funkcija ir nepieļaut / kavēt audzēju veidošanos / progresiju. Mutācijas šajos gēnos inaktivē to kodētos proteīnus, tādējādi dod iespēju veidoties audzējam Funkcionāli audzēju suprosor-gēni ir šūnas cikla regulatori, kontrolpunktu proteīni, DNS bojājumu sensori, apoptozes veicinātāji u.c. + Ģenētiskās stabilitātes gēni (DNS reparācijas enzīmi, enzīmi, kas piedalās hromosomu segregācijā u.c.) Visbiežāk – recesīvi, taču var būt haplo-nepietiekami

11. Audzēju supresor- gēnu inaktivācijas mehānismi Non-disjunction, mitotic recombination or deletion Mutation, LOH Classical Knudson two-hit model DNA methylation

12. Cik mutāciju ir katrā individuālā audzējā?

13. Vēža genoma analīzes metodes: • Visa genoma sekvenēšana • Visa eksomasekvenēšana • Vēža gēnu paneļu sekvenēšana • RNS sekvenēšana

14. Cik mutāciju ir katrā individuālā audzējā? Pleasance ED etal (Nature, 2010) – pilnībā nosekvenēmetastatiskas melanomas šūnu līnijas genomu - atrod 33 345 bāžu nomaiņas, 292 no tām – kodējošajos rajonos, lielākā daļa C>T/G>A tranzīcijas – UV starojuma izraisīti DNS bojājumi, 66 insercijas/delēcijas un 37 lielas strukturālas izmaiņas. Lee W etal (Nature, 2010) – pilnībā nosekvenē primāra plaušu vēža audu un relatīvi normālu plaušu audu genomu (attiecīgi 60 un 46-kārtīgā pārklājumā). Atrod >50 000 somatisku sekvences variantu (17.7 mutācijas/1Mb); validē >530 mutācijas kodējošajos rajonos, novēro, ka mutāciju biežums dažādos genoma rajonos ir ļoti atšķirīgs (transkribētajos rajonos un promoteros - zemāks kā nekodējošajā daļā, tomēr visaugstākais aminoskābju nomaiņu biežums ir kināžu gēnos )

15. Izmantojot eksomasekvenēšanu, metilēšanas analīzi un mRNS un miRNS profilēšanu, analizē 224 kolorektālo audzēju genomus: • Mutāciju biežums variē no <1/Mb līdz >100/Mb • 16% audzēju – hipermutēti (>8.24/Mb); saistīti ar MSI un DNS reparācijas enzīmu inaktivāciju • Biežas mutācijas 32 gēnos • >94% atrod mutācijas WNT signālceļā – nozīmīgs terapijas mērķis

16. Ne visas mutācijas ir funkcionāli svarīgas/iesaistītas audzēju veidošanā – ir “driver” un “passenger” mutācijas; Driver mutācijas – dod selektīvas priekšrocības, veidojas samērā reti, bet akumulējas pozitīvas selekcijas ceļā; passenger – neitrālas; nav pozitīvas vai negatīvas selekcijas

17. Starptautiskais vēža genoma izpētes konsorcijs

21. Douglas Hanahan & Robert Weinberg (2000/2011): The Hallmarks of Cancer

22. (1) Audzēju šūnām nav nepieciešami ārēji augšanas signāli Normālām šūnām ir nepieciešami augšanas signāli (augšanas faktori, signāli no ECM, starpšūnu kontakti u.c.), lai tās proliferētu. Audzēju šūnas var proliferēt bez ārējiem signāliem. • Veidi, kā audzēji nodrošina augšanas signālus: • Producē augšanas faktorus (PDGF, EGF, TGF u.c.), kas darbojas autokrīnā vai parakrīnā veidā • Pastiprināti producē augšanas faktoru receptorus (EGF-R, HER2/neu) • Konstitutīvi aktīvi mitogēno signālu pārnese ceļi (SOS-Ras-Raf-MAPK kaskāde; piemēram, 40% melanomas gadījumu ir atrastas aktivējošas mutācijas B-Raf gēnā)

23. (2) Audzēju šūnas inaktivēproliferācijuinhibējošos signālus Lielākajā daļā audzēju ir inaktivētspRb signālu pārneses ceļš, tikai atšķiras veids, kā tas tiek panākts – mutācijas pRb, p16 mutācijas, ciklīnu pārprodukcija u.c.

24. (3) Audzēju šūnas izvairās no apoptozes • Audzēju šūnas izvairās no apoptozes, inaktivējottās sensorus vai efektorus. Piemēram: • Paaugstināta BCL-2 ekspresija. BCL-2 ir intracelulārsapoptozes inhibitors, kas bloķē citohroma C izplūšanu no mitohondrijiem. • Paaugstināta anti-apototiskoizdzīvošanas faktoru, piemēram, survivin produkcija • P53inaktivācija mutāciju rezultātā. P53 ir galvenais DNS bojājumu sensors.

25. (4) Audzēju šūnām ir neierobežots replikācijas potenciāls Normālas šūnas dalās 50-70 reižu  replikatīvā šūnu senescence Telomēras - ~10 000nt gari GGGTTA atkārtojumi hromosomu galos; pēc katras replikācijas saīsinās par ~50-100nt 85-90% audzēju producē telomerāzi – enzīmu, kas atjauno telomēru garumu; pārējos gadījumos – starphromosomu rekombinācijas

26. (5) Audzēji spēj inducēt angioģenēzi Producē VEGF – endoteliālo šūnu augšanas faktors un anti-apoptotisks signāls; Nomāc angioģenēzes inhibitorus – angiostatīnu un trombospondīnu.

27. (6) Audu invāzija un metastāžu veidošana • Daudzpakāpju process, kas ietver: • Audzēju šūnu invāziju, izkļūšanu cauri bazālajai membrānai un saistaudiem • Iekļūšanu asinsvadā / limfmezglā • Izdzīvošanu asinsritē • Piestiprināšanos asinsvada sieniņai, ekstravazāciju • Sekundārā audzēja veidošanos • Mazāk kā 1 no 1000 šūnām, kas iekļūst asinsritē izveido sekundāru audzēju • Nodrošina: izmaiņas starpšūnu un šūnu-ECM kontaktos (E-kadherīna zudums, izmaiņas CD44 ekspresijā u.c.), ekstracelulāroproteāžu ekspresija (MMPs, uPA u.c.) un to dabisko inhibītoruinaktivācijautt…

28. (7) Enerģijas metabolisma pārprogrammēšana Matthew G Vander Heiden et al, Science 2009 Warburga efekts: vēža šūnas, arī O2 klātbūtnē, enerģiju iegūst, galvenokārt, glikolīzes ceļā – 18 x zemāka ATF produkcijas efektivitāte kā oksidatīvās fosforilēšanās gadījumā!!! Vēža šūnas to var atļauties, paaugstinot glikozes transportieru, piemēram, GLUT1 ekspresiju, kas nodrošina pietiekamu glikozes koncentrāciju citoplazmā. Funkcionālā jēga nav līdz galam skaidra – iespējams, glikolīzes starpprodukti nodrošina efektīvākus biosintēzes ceļus.

29. (8) Izvairīšanās no imūnreakcijas Dunn GP et al, Nat Immunol, 2002 Eliminēšana: efektīva audzēju šūnu iznīcināšana Līdzsvars: imūnsistēmas spiediens veicina tādu audzēja šūnu selekciju, kas ir rezistentas pret imūnreakciju Izbēgšana: imunoloģiski izselekcionētās audzēja šūnas spēj augt imunokompetentā organismā

30. (9) Hronisks iekaisums veicina audzēju attīstību Hronisks iekaisums ir daudzu audzēju priekš-vēža stāvoklis (piemēram, hronisks atrofisks gastrīts ir kuņģa vēža priekš-vēža stāvoklis, aknu ciroze – aknu vēzis, hronisks kolīts – kolorektālais vēzis). Hroniska iekaisuma gadījumā imūnsistēmas šūnas (makrofāgi, neitrofili, daļēji diferenciētas mieloīdās šūnas u.c.) var producēt: augšanas faktorus, apoptozes inhibitorus, angioģenēzes stimulatorus, ekstracelulāromatriksu modificējošus enzīmus u.c, kas veicina vēža šūnu proliferāciju, izdzīvošanu, invazivitāti un metastazēšanu un angioģenēzi. Turklāt, iekaisuma procesos tiek producētas mutagēnas vielas, piemēram ROS, iNOS.

31. (10) Ģenētiskā nestabilitāte – līdzeklis vēža fenotipa iegūšanai Šo fizioloģisko īpašību iegūšanai ir nepieciešamas mutācijas vairākos specifiskos gēnos vienā šūnā. Paaugstināts mutāciju biežums veidojas pateicoties mutācijām gēnos, kas sargā genoma stabilitāti. Mutācijas, kas izraisa genoma nestabilitāti ir nepieciešamas audzēja iniciācijai un progresijai. Ģenētiskajai nestabilitātei ir jābūt pietiekamai, lai nodrošinātu selekciju, bet ne pārmērīgai. Selektīva barjera - piemēram, hipoksija, augšanas faktoru nepietiekamība

32. Ģenētiskās nestabilitātes veidi: Mikrosatelītu nestabilitāte (MIN) MIN rodas pateicoties mutācijām DNS reparācijas (kļūdu labošanas) gēnos un izpaužas kā paaugstināts mutāciju biežums nukleotīdu līmenī (2-3 reizes lielāks mutāciju biežums kā normālās šūnās). Šī fenotipa marķieris ir mikrosatelītu garuma atšķirības (mikrosatelīti ir gari mono- vai di-nukleotīdu atkārtojumi, kuros īpaši bieži rodas mutācijas Hromosomālā nestabilitāte (CIN) Epiģenētiskā “nestabilitāte”

33. Ģenētiskās nestabilitātes veidi: Mikrosatelītu nestabilitāte (MIN) Hromosomālā nestabilitāte (CIN) CIN raksturīgas hromosomu skaita vai struktūras izmaiņas, kas rodas hromosomu segregācijas defektu rezultātā mitozes laikā. Tās rodas pateicoties mutācijām gēnos, kas iesaistīti G2/M kontrolpunktā, mitotiskās vārpstas veidošanā, centrosomu darbībā un hromosomu segregācijā. Epiģenētiskā “nestabilitāte”

34. Ģenētiskās nestabilitātes veidi: • Mikrosatelītu nestabilitāte (MIN) • Hromosomālā nestabilitāte (CIN) • Epiģenētiskā “nestabilitāte” • Daudzos audzējos ir novērojamas dažādas epiģenētiskas izmaiņas, ieskaitot DNS hipometilēšanu, kas var būt pamatā proto-onkogēnu aktivācijai vai hipermetilēšanu, kas var izraisīt tumor-supresor gēnu inaktivāciju. Taču joprojām nav skaidrs: • Kas izraisa izmaiņas DNS metilēšanā? • Vai tās ir atkarīgas no mutācijām kādā konkrētā gēnā? • Vai epiģenētiskās izmaiņas var iniciēt karcinoģenēzi?

36. Audzēju celulārā un ģenētiskā heterogenitāte, mikrovide un vēža cilmes šūnas Quail DF & Joyce J, NatMed, 2013

37. Vēža šūnu ģenētiskās heterogenitātes veidošanās modeļi Russnes HG et al, J Clin Invest, 2011

38. Vēža cilmes šūnas (Cancerstemcells (CSC), Tumourinitiatingcells (TIC), Stemcell-likecells (SCLC) Vēža šūnu populācija, kam piemīt cilmes šūnu īpašības (pašatjaunošanās un spēja radīt daļēji diferencētas meitšūnas), spēj iniciēt audzēja veidošanos eksperimenta dzīvniekos un ir rezistentas pret staru un ķīmijterapiju

39. Vēža cilmes šūnu īpašības • Ir cilmes šūnas virsmas marķieri, piemēram CD133, CD44, ABCB5 • Ekspresē cilmes šūnām raksturīgus transkripcijas faktorus un gēnu ekspresijas regulatorus – Oct4, Lin28, Nanog, Sox2 • Rezistentas pret staru un ķīmijterapiju • CSC biežums dažādos audzējos var būt dažāds – 0.1-30% no visas šūnu masas • Neliels skaits (~100-500) CSCs spēj veidot audzēju imunodeficītās pelēs injicējot audzēju šūnas, kamēr ir vajadzīgas ~106 nešķirotas šūnas, lai iniciētu audzēja veidošanos

40. No kā rodas vēža cilmes šūnas?

41. Hipoksijas atbilde • Epiteliāli-mezenhimālatranzīcija • Audzēja mikrovides ietekme • Ķīmijterapijas ietekme? Vēža (cilmes) šūnu plasticitāte

42. Vēža cilmes šūnas kā terapeitiskais mērķis www.eurostemcell.org

43. Vēža cilmes šūnas kā terapeitiskais mērķis

44. Iedzimta vēža predispozīcija Audzēji attīstās somatisku mutāciju rezultātā. Bet... Katra indivīda risku saslimt nosaka iedzimtas mutācijas (vai polimorfismi), kas var palielināt (vai samazināt) risku, taču neiedzimst pats audzējs.

45. Iedzimto vēža predispozīcijas sindromu pazīmes: • Ģimenes vēsture ar vairākiem saslimšanas gadījumiem pirmās un otrās pakāpes radiniekiem (krūts vēzim – vismaz 3) • Agrāks saslimšanas vecums kā sporadiskajos gadījumos (krūts vēzim pirms 46 gadu vecuma) • Multipli primārie audzēji (piemēram, krūts un olnīcu Ca) • Bilaterāli tumori

46. Vēža predispozīcijas gēni: • Pašlaik ir zināmi vairāk kā 30 gēni, kuru mutācijas (iedzimtās!) ir saistītas ar vēža predispozīcijas sindromiem • Funkcionālās kategorijas: • Gēni, kas iesaistīti šūnu proliferācijā, izdzīvošanas signālos, starpšūnu komunikācijā (galvenokārt, audzēju supresori) • Ģenētiskās stabilitātes gēni • Gēni, kas saistīti ar kancerogēnu vielu metabolismu un detoksifikāciju

47. Gēni, kas saistīti ar vēža predispozīcijas sindromiem

49. Molekulāro testu pielietojums klīniskajā praksē

50. Filadelfijas (Ph) hromosoma – biomarķieris hroniskās mieloleikozes (HML) diagnostikai Ph hromosoma sastopama >95% HML gadījumu un BCR-ABL hibrīdais proteīns ir saistīts ar leikozes iniciāciju.