Føtomaternell Blødning Diagnostikk

1. Føtomaternell BlødningDiagnostikk Elzbieta Golebiowska Avdeling for immunologi og transfusjonsmedisin, OUS Nasjonal blodbankkonferanse Oslo 23. – 25. September 2009

2. Intrauterin fosterdød Neonatal anemi uten kjent årsak Mistanke om blødning av andre årsaker Mistanke om hemoglobinopatier Sigdcelleanemi og talassemi I Blodbanken i Oslo (BiO) utføres det 150-180 analyser per år Indikasjoner

3. Hemoglobin hos foster • Fetal hemoglobin (HbF) består av to alfa og to gamma kjeder. • Foster hemoglobin binder oksygen med større affinitet enn voksen Hb, noe som gir bedre tilgang til oksygen fra mors blodbane. • Etter fødsel slutter produksjon av HbF og mengden synker til normalt nivå for voksne mennesker (0 - 2% av total hemoglobin)

4. Kleihauer-Betke test • Utredning ved mistanke om Føtomaternell blødning har i mange år vært basert på Kleihauer-Betke test, i bruk siden 1957 • Testen tar utgangspunkt i at Hemoglobin F ikke så lett lar seg eluere slik som Hemoglobin A • Ulemper • Utstryket må være tynt, og farging må være riktig • Tidskrevende • Subjektivt, avlesning er avhengig av personale • Større sannsynlighet for feilaktige lave verdier ved stor føtomaternell blødning ( konsekvensen er ikke tilskrekklig mengde av anti-D profylakse), feilaktige høye verdier, lett å forveksle føtale celler med små lymfocytter eller voksne celler som inneholder Hemoglobin F - F celler.

5. Bilde av utstryk med føtale celler Føtale celler Voksne celler

6. Bilde av utstryk med føtale og mange voksne celler med hemoglobin F- F celler

7. Flowcytometriske metoder • Utredning med anti-D alene er ikke tatt i bruk i BiO fordi den er begrenset til Rh(D)negativ mor og Rh(D)pos barn • Bare 15% av gravide kvinner er Rh(D) negative • Anti-HbF kombinert med anti–D dekker rekvirentenes behov • Etter utprøving av reagenser som fantes i 2003/2004, valgte vi reagenser fra Chemicon • Metoden var validert i forhold til Kleihauer-Betke i 20 kunstige blandinger (mannlig giver + føtale celler fra navlestrengsblod) med meget bra overensstemmelse

8. Flowcytometriske metoder (fortsettelse) • Prøvemateriale-EDTA blod • Pasientprøver testes alltid sammen med kontroller • Vi valgte å bruke hjemmelagede kontroller • Cellene fikseres med 0,05% glutaraldehyd, permabiliseres med 0,1%Triton X–100 og farges med anti-HbF, eller både anti-D og anti-HbF • Fetal hemoglobin (HbF) består av to alfa og to gamma kjeder. Det er gamma kjeder som farges med anti-HbF • Referanseverdier for prosentandel celler som inneholder HbF (eget materiale) hos menn og ikke gravide kvinner er 0-0,17% • Referanseverdier fra litteratur for voksne er 0 - 2%.noen oppgir verdier opp til 7% av erytrocytter

9. Føtomaternell blødning : mor Rh(D)negfoster Rh(D) pos Føtomaternell blødning er på ca 1.81% som tilsvarer ca 90ml (45 ml pakkede erytrocytter)

10. Føtomaternell blødning : mor Rh(D)neg foster Rh(D) pos • En dose anti-D (1500 IE) nøytraliserer en føtomaternell blødning på ca 30 ml Rh(D) positivt blod. • Ved verifisert føtomaternell blødning på mer enn 30 ml (15 ml pakkede blodceller), skal man gi økt dose anti-D immunglobulin. • 1 dose ved anslått blødning <30 ml, 2 doser ved blødning mellom 30-50 ml, 3 doser ved blødning 50-75 ml osv. Veileder i fødselshjelp, Legeforeningen/ Norsk Gynekologisk Forening (2008), kapittel 18.1

11. Føtomaternell blødning : mor Rh(D)neg foster Rh(D) pos • Volum av pakkedeRBCs = % positive events x 1800 ml/100 x 122/100 • 1800 ml er antatt maternal RBC volum. • For å "oversette" volum av pakkede RBC ganger man resultatet med 2 (for at det skal samsvare medfetal hematokrit på ca 51%). (Dziegiel MH et al. Transf Med 2006) • Volum av pakkedeRBCs = % positive events x 24 (vedlegg til IQ Products)

12. Føtomaternell blødning: anti-HbF Barn født med anemi pga Føtomaternall blødning Føtomaternall blødning på 0.21%

13. Flowcytometriske metoder (fortsettelse) • Metoden er rask og reproduserbar • Ulemper • ikke tydelig nok separering mellom voksne erytrocytter som inneholder hemoglobin F(F celler) og føtale erytrocytter (gjelder mødre med mange F celler) • Noen problemer med aggregater, muligens pga overfiksering • Reagenser fra Chemicon oppfyller ikke krav om CE merking • Metoden brukes fortsatt i rutinen, men behovet for en metode som gir bedre resultater og ”penere” plots gjorde at vi nå satser på nye reagenser fra IQ Products

14. Fetal Cell Count Kit • Metoden baserer seg på farging av to intracellulære parametre • Gamma-kjeder i fetal hemoglobin som farges med anti-HbF konjugert med PE • Carbonic Anhydrase – enzym som finnes i alle voksne erytrocytter uavhengig av Hemoglobin type, som farges med anti-CA konjugert med FITC

15. HbF+/CA++(0.5%) Neonatal anemi Neonatal anemi HbF+ (4.42%) HbF-/CA++ Barn født med neonatal anemi

16. Neonatal anemi (fortsettelse)

17. Konklusjon • Fetal Cell Count Kit fra IQ er CE merket • Alle reagenser er inkludert • Med testen kan man separere 3 forskjellige RBC populasjoner: voksne , fosterets og voksne F celler • Metoden gir nøyaktig kvantifisering av fosterets celler • Testen kan kombineres med anti-D ved behov (reagenser fra IBGRL er CE merket )

18. Takk!