1 / 89

R N A

R N A. Falten & Finden. Übersicht:. RNA falten Sekundärstrukturen und Funktion Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence Grundidee Vorgehen Schritt 1 Vorgehen Schritt 2 Beispiele Leptomonas collosoma Bakteriophage  Auswertung Probability Profiling Accessibility Plots

ghazi
Télécharger la présentation

R N A

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. R N A Falten & Finden

  2. Übersicht: • RNA falten • Sekundärstrukturen und Funktion • Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence • Grundidee • Vorgehen Schritt 1 • Vorgehen Schritt 2 • Beispiele • Leptomonas collosoma • Bakteriophage  • Auswertung • Probability Profiling • Accessibility Plots • Samplegröße • Sfold • RNA finden Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  3. Übersicht: • RNA falten • Sekundärstrukturen und Funktion • Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence • Grundidee • Vorgehen Schritt 1 • Vorgehen Schritt 2 • Beispiele • Leptomonas collosoma • Bakteriophage  • Auswertung • Probability Profiling • Accessibility Plots • Samplegröße • Sfold • RNA finden Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  4. Sekundärstrukturen und deren Funktion • Ständig wiederkehrende Motive in RNA-Struktur erkennbar • RNA besteht hauptsächlich aus Kombinationen dieser Motive • Achtung: keine Pseudoknoten berücksichtigt Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  5. Sekundärstrukturen und deren Funktion • RNA-Sekundärstrukturen wichtig für: • Katalyse (Ribozyme) • RNA-Splicing • Regulation der Translation • Interaktionen zwischen Nucleinsäuren • Sekundärstrukturen bestimmen auch die Tertiärstruktur  korrekte Sekundärstruktur wichtig für korrekte Tertiärstruktur  korrekte Sekundärstruktur wichtig für korrekte Funktion • Strukturbestimmung experimentell schwierig • Besonders für langkettige Nucleinsäuren  rechnergestützte Strukturvorhersage extrem wichtig Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  6. Übersicht: • RNA falten • Sekundärstrukturen und Funktion • Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence • Grundidee • Vorgehen Schritt 1 • Vorgehen Schritt 2 • Beispiele • Leptomonas collosoma • Bakteriophage  • Auswertung • Probability Profiling • Accessibility Plots • Samplegröße • Sfold • RNA finden Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  7. Algorithmus - Grundidee • Annahme: Faltung nur in bestimmte Sekundärstrukturelemente • Ansatz verfolgt Minimierung der freien Energie • Energie (U): • Nimmt ab, wenn z.B. Bindungen ausgebildet werden • Entropie (S): • Maß für die „Unordnung“ eines Systems • Nimmt nach 2. Hauptsatz der Thermodynamik zu • Freie Energie (Helmholtz Energie, F): F = U – T*S • Setzt Entropie und Energie in Beziehung Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  8. Algorithmus - Grundidee • Algorithmus arbeitet in 2 Schritten: • Schritt 1: • Untersucht bildbare Sekundärstrukturen der Sequenz (und ihre freie Energie) • Errechnet „Zustandssummen“ für Teilsequenzen • Schritt 2: • Errechnet mit Zustandssummen Gibbs-Boltzmann-Verteilung (Ws) der Strukturen • Wählt zufällige Kombination von Sekundärstrukturen aus 1) 2) ********************************* --______------_----_--_-_---- „Teilergebnisse“ Sammlung von Basenpaaren Sekundärstruktur Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  9. Algorithmus - Grundidee - Probleme • freien Energie für Sekundärstrukturen nur approximiert  durch Änderungen andere Faltungen wahrscheinlicher • Tertiärstruktur (und Effekte) unberücksichtigt • Struktur mit minimaler freier Energie (MFE) muss nicht die reale sein  Realität suboptimal Aber: Algorithmus sucht nicht unbedingt die wahrscheinlichsten Teilstrukturen aus Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  10. Übersicht: • RNA falten • Sekundärstrukturen und Funktion • Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence • Grundidee • Vorgehen Schritt 1 • Vorgehen Schritt 2 • Beispiele • Leptomonas collosoma • Bakteriophage  • Auswertung • Probability Profiling • Accessibility Plots • Samplegröße • Sfold • RNA finden Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  11. Algorithmus – Vorgehen (I) • Berechnen der „Boltzmann-Statistik“ („Gibbs-Boltzmann-Verteilung“) einer Sekundärstruktur I für eine gegebene Sequenz S nach • E(S, I): freie Energie der Sekundärstruktur für diese Sequenz • R: Gaskonstante • U: Zustandssumme aller zulässigen Sekundärstrukturen für S • Bedeutung: Wahrscheinlichkeit einer bestimmten Sekundärstruktur für eine gegebene Sequenz unter Berücksichtigung aller möglichen Sekundärstrukturen Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  12. Algorithmus – Vorgehen (I) – Defs. Rij 3‘ 5‘ ….. ….. 1… i ….. j… n • n: Anzahl an Ribonukleotiden • Rij: Teilsequenz von Nukleotid i bis Nukleotid j 1 ≤ i,j ≤ n • rk: Nukleotid an Position k, rk{A, C, G, U} i ≤ k ≤ j • Iij: Sekundärstruktur für Rij, ri und rj paaren eventuell • IPij: Sekundärstruktur für Rij, ri und rj paaren miteinander Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  13. Algorithmus – Vorgehen (I) Benötigt in: Erinnerung: Teilsequenz • Zustandssummen für Rij: mit Sekundärstruktur Iij: mit Sekundärstruktur IPij: (i und j gepaart) • E(Rij, x): freie Energie der Sekundärstruktur x für Rij • R: Gaskonstante • T: 310,15 K • Rekursive Berechnung durch Algo vom McCaskill Sek.-Strt. Sek.-Strt. Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  14. Algorithmus – Vorgehen (I) • Berechnung der u(i, j) bzw. up(i, j)….. • Mit u(1, n) kann Boltzmann-Verteilung (Ws) einer I1n für R1n berechnet werden Sek.-Strt. = S (Gesamtsequenz) Genutzt in Schritt 2 Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  15. Übersicht: • RNA falten • Sekundärstrukturen und Funktion • Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence • Grundidee • Vorgehen Schritt 1 • Vorgehen Schritt 2 • Beispiele • Leptomonas collosoma • Bakteriophage  • Auswertung • Probability Profiling • Accessibility Plots • Samplegröße • Sfold • RNA finden Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  16. Algorithmus – Vorgehen (II) Rij 3‘ • Rij kann 5 verschiedene Zustände annehmen: 5‘ ….. ….. 1… i ….. j… n Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  17. Algorithmus – Vorgehen (II) – nötige Variablen(1) • Ws, eine dieser 5 Möglichkeiten zu wählen (unbekannt, ob ri und rj paaren): Strafe für Paarung AC bzw. GU freie Energie für dangling 5‘ freie Energie für dangling 3‘ Array mit zuvor berechneten Variablen Zuerst h variieren, dann zu den Positionen von h l verändern Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  18. Algorithmus – Vorgehen (II) – nötige Variablen(2) • Bekannt, dass ri und rj paaren  Ws für die 5 möglichen Strukturen: freie Energie eines Hairpin geschlossen von ri und rj freie Energie des Stacking-Bp ri und rj freie Energie eines Bulge bzw. Interior Loop Möglichkeiten, zwischen h und l einen Bulge bzw. Interior Loop zu sampeln Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  19. Algorithmus – Vorgehen (II) • Sampeln: • berechne die Struktur-Ws für Rij (mit den u(i,j) aus Schritt 1) • wähle über eine Zufallsvariable gemäß den berechneten Wahrscheinlichkeiten eine Möglichkeit • Benutzt zwei Stacks • A: verwaltet Tupel (i, j, I) (noch zu faltendes Teilstück) • Sequenz von Nukleotid i bis j • I = 1: Nukeotid i und j bilden eine Bindung aus; I = 0: unbekannt, ob i und j paaren • B: • Wird durch Algorithmus gefüllt • sammelt Basenpaare und ungepaarte Basen  enthält nötige Informationen für Sekundärstruktur • Startzustand: • A enthält (1, n, 0) 0 1 Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  20. Algorithmus – Vorgehen (II) Erinnerung: A: ungefaltete Bereiche B: Bindungsbeziehungen I = 0 1) Start mit R1n (also (1, n, 0) auf Stack A), Paarung nicht bekannt bilde die P0, Pij, {Phi}, {Pil}, {Ps1h} für i = 1, j = n; wähle eine Möglichkeit Mögliche Ergebnisse: Keine Paarung, füge ungepaarte Basen von 1 bis n in Stack B ein (1, n, 1) in Stack A einfügen (h, n, 1) in Stack A einfügen ungepaarte Basen 1 bis (h-1) in Stack B einfügen (1, l, 1) & (l+1, n, 0) in Stack A einfügen (h, l, 1) & (l+1, n, 0) in Stack A einfügen Ungepaarte Basen von 1 bis (h-1) in Stack B einfügen Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  21. Algorithmus – Vorgehen (II) Erinnerung: A: ungefaltete Bereiche B: Bindungsbeziehungen 2) Nimm nächstes Tupel (i, j, I) für Rij von Stack A a) I = 0: verfahre wie im letzten Schritt: berechne die P-- b) I = 1: i und j paaren, betrachte die QijH, QijS, QijBI, QijM Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  22. Algorithmus – Vorgehen (II) 1) Sampel das erste innere Basenpaar (bilde die P--, wähle Möglichkeit, verfahre entsprechend) ….. ….. 2) Sampel das nächste Basenpaar ….. ….. 3) Wiederhole 2, bis alle abgearbeitet Nimm neues Tupel von Stack A Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  23. Algorithmus – Vorgehen(II) Stack A Stack B Für jedes Basenpaar innerhalb des MB-Loop • Sampling im Überblick: Schritt 1 nimm (i, j, I) von A Stack A leer? I = 0 Sampel Basenpaar Möglichkeiten der Paarbildung bestimmt I = 1 Sampel Loop Struktur bestimmt, zu der Basenpaar zugehörig ist Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  24. Algorithmus – Vorgehen(II) • Samling-Schritt arbeitet, bis Stack A leer ist • Stack B enthält Angaben über Paarungen der n Basen in R1n  1 Sekundärstruktur Wahrscheinlichkeit eines Struktur nimmt exponentiell mit wachsender freier Energie ab (bedingt durch Boltzmann-Verteilung): • Mit hoher Wahrscheinlichkeit: optimale MFE • Mit relativ hoher Wahrscheinlichkeit: gute (suboptimale) MFE • Mit geringer Wahrscheinlichkeit: schlechte MFE • Sinnvoll: Sampling-Schritt mehrfach ablaufen lassen  statistisch repräsentatives Ergebnis „Konsensus“-Struktur Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  25. Übersicht: • RNA falten • Sekundärstrukturen und Funktion • Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence • Grundidee • Vorgehen Schritt 1 • Vorgehen Schritt 2 • Beispiele • Leptomonas collosoma • Bakteriophage  • Auswertung • Probability Profiling • Accessibility Plots • Samplegröße • Sfold • RNA finden Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  26. Beispiele – Leptomonas collosoma • Faltung der „spliced leader“ RNA (SL RNA) von L. collosoma • 56 nt lang • 2 Sekundärstrukturen identifiziert (Funktion unbekannt) • Vorgehen: • Mit Schritt 1 die Ws der Substrukturen berechnet • 1000 mal gesampelt • Entstandene Sekundärstrukturen verglichen • Ergebnis: • 2 generelle Klassen • Klasse 1 mit 3 Unterklassen (A, B, C) • Klasse 2 mit 2 Unterklassen (A, B) Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  27. Beispiele – Leptomonas collosoma • Klasse 1: Alle Unterklassen mit 2 identischen Helices • 1: • 2: Weitere 2 Helices gemeinsam Unterschied in Hairpin Quadratgröße = Häufigkeit der Basenpaare in Samples mfold(3.1)-Struktur  MFE-Struktur Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  28. Beispiele – Leptomonas collosoma • Klasse 2: Unterklassen erneut mit 2 identischen Helices • Unterklasse B mit zusätzlichem Stem am 5‘-Ende Quadratgröße = Häufigkeit der Basenpaare in Samples Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  29. Beispiele – Leptomonas collosoma • Repräsentanten der Klasse 1: identisch mfold(3.1)-Struktur  MFE-Struktur Bis auf Fehlen der kurzen Helix mit mfold-Struktur identisch Experimentell bestimmte Faltungsart 1 Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  30. Beispiele – Leptomonas collosoma • Repräsentanten der Klasse 2: identisch Experimentell bestimmte Faltungsart 2 Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  31. Beispiele – Leptomonas collosoma • Gesamtübersicht Häufigkeiten der Klassen und deren Repräsentanten • Tatsächliche Faltungsart 1 • mfold-Struktur (MFE) • Leicht veränderte mfold-Struktur (suboptimale MFE) • Tatsächliche Faltungsart 2  Tatsächliche Strukturen mit geringer Ws Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  32. Übersicht: • RNA falten • Sekundärstrukturen und Funktion • Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence • Grundidee • Vorgehen Schritt 1 • Vorgehen Schritt 2 • Beispiele • Leptomonas collosoma • Bakteriophage  • Auswertung • Probability Profiling • Accessibility Plots • Samplegröße • Sfold • RNA finden Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  33. Beispiele – Bakteriophage  • Zwischen-Ergebnis aus Tests mit L. collosoma:Algo erzeugt viele alternative Strukturen • Weitere Untersuchung mit Vorhersage von mRNA-Strukturen • Charakteristische Bereiche der cIII-mRNA des Bakteriophagen : • das Startcodon (AUG) (0 bis 3) • die Shine-Dalgarno-Sequenz (-13 bis -7) nötig zur Translationsinitiierung • Kommt in 2 Konformationen vor • Vorgehen: • Sampling-Schritt 100 mal wiederholt • Die 100 erzeugten Strukturen von Hand betrachtet und charakterisiert Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  34. Beispiele – Bakteriophage  • Struktur A: Shine-Dalgarno-Sequenz und Startcodon in Sekundärstrukturen keine Translation • Struktur B: Shine-Dalgarno-Sequenz und Startcodon zugänglich Translation möglich leftmost stem middle stem rightmost stem Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  35. Beispiele – Bakteriophage  • Ergebnis des Samplings: • 89/100 Strukturen leichte Variationen von Struktur A • leftmost-Stem in 67/89 exakt vorhergesagt • rightmost-Stem in 72/89 nahezu exakt vorhergesagt (gelegentlich 2 zusätzliche Paare) • 3/100 Strukturen Variationen von Struktur B zusätzliche Helix in SD-Sequenz enthalten • 8 Strukturen, die weder an A noch an B erinnern leftmost stem middle stem rightmost stem Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  36. Übersicht: • RNA falten • Sekundärstrukturen und Funktion • Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence • Grundidee • Vorgehen Schritt 1 • Vorgehen Schritt 2 • Beispiele • Leptomonas collosoma • Bakteriophage  • Auswertung • Probability Profiling • Accessibility Plots • Samplegröße • Sfold • RNA finden Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  37. Beispiele - Auswertung • Algorithmus erzeugt leicht suboptimale Faltungen, die nahe der MFE liegen • ABER: suboptimale Faltung ist nicht gleich tatsächlicher (suboptimaler) Faltung • Erklärung der Autoren: unbekannte Einflüsse der Tertiärstruktur für verantwortlich für Stabilität • Besser geeignet zur Faltung von mRNA als für funktionelle RNA (z.B. spliced leader) Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  38. Übersicht: • RNA falten • Sekundärstrukturen und Funktion • Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence • Grundidee • Vorgehen Schritt 1 • Vorgehen Schritt 2 • Beispiele • Leptomonas collosoma • Bakteriophage  • Auswertung • Probability Profiling • Accessibility Plots • Samplegröße • Sfold • RNA finden Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  39. Probability Profiling • Einzelsträngige (ungepaarte) RNA-Regionen interagieren potentiell mit • DNA • RNA • Proteinen (z.B. in Translation) • Vorhersage dieser „accessible sites“ mit dem Sampling-Teil des Algorithmus • Erstellen von „Probability Profiles“ (Diagramme) der Weite W (in Nukleotiden) • An Position i wird die Ws aufgetragen, dass die Nukleotide i bis i+(W-1) ungepaart sind(ergibt sich aus Multiplikation der Einzelwahrscheinlichkeiten (aus Statistik)) • Zum Vergleich: ss-count; Statistik, in wieviel Prozent aller erzeugten Faltungen Base i ungepaart war Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  40. Probability Profiling - Beispiel • mRNA Homo sapiens-Glutamyl-Hydrolase • Nukleotide 0 – 60 Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  41. Probability Profiling - Beispiel • mRNA Homo sapiens-Glutamyl-Hydrolase • Nukleotide 1261 – 1322 Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  42. Probability Profiling - Ergebnis • MFE-Struktur gibt für Vorhersage von „accessible sites“ keine Hinweise • Da nur 1 Struktur die MFE-Struktur ist • Binäre Entscheidung: in 1 Struktur ist Base in Basenpaar oder nicht • ss-count: betrachtet nur Statistik eines Nukleotids, keine Aussage über nachfolgende • Probability Profile: verlässlichste Aussage der 3 Möglichkeiten • da Ws der nachfolgenden Paarungen berücksichtigt Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  43. Probability Profiling für Loops • Bisher nur berücksichtig ob gepaart oder ungepaart • Sampling-Schritt gibt aber mit zurück, in welchem Loop-Typ sie enthalten sind  Probability Profiling für bestimmte Loops möglich Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  44. Probability Profiling für Loops • Loop-Probability-Profiles für Escherichia coli Alanin-tRNA Hairpin External Bulge Internal Multi Multi „dangling“-3‘-Ende aus Nukleotiden Kleeblattstruktur der tRNA Enthält keine Bulges oder Internal Loops  dort keine Peaks 16% der gesampelten Strukturen haben einen einzelsträngigen Bereich, der zwei gefaltete Domänen vebrindet Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  45. Probability Profiling für Loops • Weitere Bedeutung des Hairpin-Loop-Profiles: • Höchster Peak  konserviertester Loop • HPlot-Ws der Basen des Anticodon-Loops: • G34: 0,968 • G35: 0,961 • C36: 0,962  Selbst wenn sich die restliches Strukturnicht zum Kleeblatt faltet, bleibt diese„accessible site“ erhalten • Untersuchung weiterer tRNAs interessant, aber schwierig, da modifizierte Basen vorhanden Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  46. Übersicht: • RNA falten • Sekundärstrukturen und Funktion • Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence • Grundidee • Vorgehen Schritt 1 • Vorgehen Schritt 2 • Beispiele • Leptomonas collosoma • Bakteriophage  • Auswertung • Probability Profiling • Accessibility Plots • Samplegröße • Sfold • RNA finden Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  47. Probability Profiling für Accessibility Plots • Probability Profiles geben Differenzierung zwischen gebunden / einzelsträngig • Nucleinsäuren müssen einzelsträngig sein, um zu interagieren • Probability Profiles überlagern, um Interaktion vorherzusagen • Target: Homo sapiens-Glutamyl-Hydrolase mRNA • Antisense: insgesamt 1233 nt • Gute Zugänglichkeit zwischen 730 und 750 (target) • Zugängliche Bereiche müssen nicht an gleichen Stellen liegen • Sollten aber gleich lang sein Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  48. Übersicht: • RNA falten • Sekundärstrukturen und Funktion • Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence • Grundidee • Vorgehen Schritt 1 • Vorgehen Schritt 2 • Beispiele • Leptomonas collosoma • Bakteriophage  • Auswertung • Probability Profiling • Accessibility Plots • Samplegröße • Sfold • RNA finden Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  49. Sampelgröße • Standardgröße: 1000 – repräsentativ! • Beispiel: Homo sapiens -Glutamyl-Hydrolase mRNA • 1187 nt  ~10303 Sekundärstrukturen (Vergleich: ~1080 Atome im Universum) • 2 Sammlungen von 1000 Samples erstellt • Für jede Sammlung ein Histogramm erstelltHistogramme sind identisch • Probability Profiles erstellt:nahezu deckungsgleich • Aber: keine einzige Struktur kommt doppelt vor Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

  50. Samplegröße - Histogramme Volker Hähnke: RNA - Falten & Finden

More Related