Replikacja u Eukaryota

1. Replikacja u Eukaryota Proces replikacji u Eukaryota przebiega bardzo podobnie do replikacji w komórkach bakteryjnych. Zasadniczą różnicą jest istnienie wielu ori. U drożdży podobnie jak u bakterii ori (nazywane tu ARS od ang. autonomously replicating sequence) zawiera sekwencje bogate w A i T: [A/T]TTTAT[A/G]TTT[A/T]

2. U człowieka jest ok. 30 000 ori. Znajdują się co 30 – 300 kpz. NIE SĄ DOBRZE ZDEFINIOWANE Komputerowa analiza wielu potencjalnych ori pozwoliła na zaproponowanie takiej sekwencji konsensusowej: WAWTTDDWWWDHWGWHMAWTT gdzie: W = A lub T; D = A lub G; H = A lub T lub C; M = A lub C.

3. Inicjacja replikacji: • Do ori przyłącza się kompleks ORC złożony z 6 białek (o m. cz. ~100, 82, 66, 50, 50, 28 kDa) • ORC – (ang. origin of replication complex) • ORC pełni tę samą funkcję co DnaA u bakterii Helikaza rozplata helisę a polimeraza a syntetyzuje startery na nici wiodącej i opóźnionej.

4. POLIMERAZA a Składa się z czterech podjednostek: Podjednostka 180 kDa– aktywność polimerazy DNA Podjednostki55 kDa i 48 kDa– tworząrazem prymazę. Podjednostka 68kDaspaja kompleks a może mieć też znaczenie regulatorowe (ulega fosforylacji). Syntetyzuje startery złożone z 10 nukleotydów RNA (prymaza) i 20-30 nukleotydów DNA (polimeraza) NIE MA AKTYWNOŚCI EGZONUKLEAZY

5. POLIMERAZY d oraz e • Głównymi polimerazami replikacyjnymi Eukaryota są polimerazy delta i epsilon (d i e). • Polimerazy d i e są złożone z 4 podjednostek o różnych masach cząsteczkowych: • - (p125, p66, p50, p12) • e - (p256, p80, p23, p22) • Największe podjednostki obu polimeraz zawierają zarówno aktywność polimerazy jak i 3’-5’ egzonukleazy. • Polimeraza d odpowiada za replikację nici opóźnionej • Polimeraza e odpowiada za replikację nici wiodącej Uwaga! W podręczniku „Zarys biochemii” jest informacja nieaktualna!

6. Analogicznie do Prokaryota – polimeraza replikacyjna musi oddziaływać ze strukturą, która będzie zwiększać jej kontakt z DNA, będzie zwiększać jej procesywność. Tą strukturą u Eukaryota jest PCNA(ang. proliferating cell nuclear antigen), antygen jądrowy proliferujących komórek. Trimer PCNA 3 x 29 kDa Oddziaływanie PCNA z DNA i kompleksem polimerazy reguluje RFC (replikacyjny czynnik C)

7. W trakcie syntezy nici opóźnionej: Synteza fragmentu Okazaki zostaje zatrzymana, gdy polimeraza d napotka starter poprzedniego fragmentu Okazaki. Wtedy następuje usunięcie tego startera przez działanie dwóch enzymów: Dna2 (DNA helikaza/endonukleaza 2) oraz endonukleazę Fen-1. Luka zostaje wypełniona przez polimerazę d. U EUKARYOTA NIE MA WIĘC ODPOWIEDNIKA PROKARIOTYCZNEJ POLIMERAZY I

9. ORC (ang. origin of replication complex); PCNA (ang. proliferating cell nuclear antigen); antygen jądrowy proliferujących komórek RFC (ang. replication factor C); replikacyjny czynnik C RPA (ang. replication protein A); replikacyjne białko A MCM (ang. minichromosome maintenance)

10. Przykłady polimeraz DNA u ssaków

11. Polimerazy eta oraz iota należą do rodziny Y polimeraz DNA. Uczestniczą w tzw. „translesion DNA synthesis (TLS)” ang. lesion = rana, uszkodzenie To są bardzo ciekawe polimerazy. Pracują na matrycy, ale nie dbają zbytnio o wierność replikacji. Dzięki temu mogą prowadzić replikację nawet, gdy matryca zawiera błędy (polimeraza d w tej sytuacji nie jest w stanie włączać nukleotydów do łańcucha DNA). Błędy wprowadzane przez polimerazy Y są póżniej naprawiane przez różne systemy naprawy DNA.

12. Polka współodkrywcą elementu mechanizmu naprawy DNA PAP, 2006-01-13 24-letnia Polka kierowała międzynarodowym projektem badawczym, w ramach którego dokonano bardzo ważnego odkrycia w dziedzinie biologii molekularnej - ustalono nieznany wcześniej element jednego z podstawowych mechanizmów naprawy uszkodzonego DNA. Science 16, December 2005:Vol. 310. no. 5755, pp. 1821 – 1824 Ubiquitin-Binding Domains in Y-Family Polymerases Regulate Translesion Synthesis Marzena Bienko, Catherine M. Green, Nicola Crosetto, Fabian Rudolf, Grzegorz Zapart, Barry Coull, Patricia Kannouche, Gerhard Wider, Matthias Peter, Alan R. Lehmann, Kay Hofmann, Ivan Dikic

13. Jak może się skończyć synteza nici opóźnionej w liniowych chromosomach?

15. 5’ koniec nowo syntetyzowanego DNA jest zawsze krótszy od macierzystego DNA • W nowej cząsteczce DNA fragment 3’ końca jest jednoniciowy (pojedyncza nić to 50 – 400 n) • DWA PROBLEMY • Jednoniciowy DNA jest bardzo podatny na degradację • Przy każdym podziale komórkowym chromosomy ulegałyby skróceniu

16. NAGRODA NOBLA 2009 w dziedzinie medycyny i fizjologii Elizabeth H. Blackburn Carol W. Greider Jack W. Szostak

17. Telomery tworzą duże dwuniciowe pętle TRF2 (ang. telomericrepeatbinding factor 2)

18. ten kompleks nazywa się z ang. shelterin

19. Jak może się skończyć synteza nici opóźnionej w liniowych chromosomach? Dzięki specyficznej budowie końców chromosomów – telomerów i enzymowi – telomerazie. DNA telomerów zawiera setki powtórzeń krótkich sekwencji bogatych w guanylan. Np. Tetrahymena (Orzęsek): GGGTTG Caenorhabditis (Nicień): GGCTTA Człowiek: GGGTTA 5’..... GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA-3’ 3’......CCCAATCCCAAT-5’

20. www.bccrc.ca/tfl/people_plansdor.html FISH fluorescent in situ hybridization Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ

21. TELOMERAZA – rybonukleoproteina Enzym o aktywności odwrotnej transkryptazy (telomerase reverse transcriptase) U człowieka: TERT + odcinek RNA (TERC) + 8 białek pomocniczych 5’..... GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA-3’ 3’......CCCAATCCCAAT-5’ 10 000 par zasad 400 zasad długość telomeru długość odcinka jednoniciowego

22. RNA telomerazy orzęska

24. Etapy: • przyłączenie telomerazy do telomeru • wydłużenie końca 3' (nić macierzysta) przez telomerazę - synteza DNA na matrycy RNA • wydłużenie nici opóźnionej przez polimerazę DNA - synteza DNA na matrycy DNA Telomeraza każdorazowo dodaje wiele powtórzeń charakterystycznej sekwencji telomerowej.

25. Hipoteza – skracanie telomerów warunkuje proces starzenia się? • Czy długość telomerów determinuje długość życia? • Porównując gatunki – NIE (mysz - długie telomery, człowiek – krótkie telomery) • Czy ma wpływ na długość życia osobników w obrębie gatunku – NIE WIADOMO

26. W wielu tkankach wraz z wiekem osobniczym dochodzi do skracania telomerów. Im człowiek starszy, tym ma krótsze telomery. Co z tego wynika? NIC Równoległe zachodzenie 2 procesów nie determinuje zależności między nimi. Nie wiadomo, czy istnieje jakaś zależność, a jeśli tak, to który proces jest przyczyną, a który skutkiem. Np. starzenie i siwienie i zmarszczki. Czy można powiedzieć, że starzenie jest rezultatem siwienia i pojawiania się zmarszczek?

27. W hodowlach komórkowych istnieje zależność między aktywnością telomerazy a zdolnością komórek do proliferacji. Normalne komórki wykazują ograniczoną zdolność do podziałów. Po pewnej liczbie podziałów przestają proliferować – starzenie komórkowe.

28. Wiele tkanek dorosłego człowieka zachowuje aktywność telomerazy. Jakie to tkanki? • Te, które muszą intensywnie proliferować: • Komórki warstwy podstawnej naskórka • Komórki nabłonka jelit • Komórki warstwy podstawnej endometrium (błony śluzowej macicy) (zależnie od fazy cyklu miesięcznego) • Komórki mieszka włosowego • Aktywowane limfocyty

29. Telomeraza i nowotwory Aktywność telomerazy nie stymuluje nowotworzenia jednak Krótkie telomery i brak aktywności telomerazy mogą hamować rozwój nowotworów. Podczas nowotworzenia, po serii podziałów komórkowych zmutowane komórki nie mogą dalej się dzielić, chyba, że zostanie przywrócona ekspresja telomerazy lub uruchomiony inny mechanizm wydłużania telomerów. Wiele – ale nie wszystkie! – nowotwory mają aktywność telomerazy.