VIRY A 26S PROTEAZOM: cesta k destrukci

1. VIRY A 26S PROTEAZOM:cesta k destrukci Zuzana Kauerová 2004/2005

2. 1. Když se řekne proteazom • Velké membránové multipodjednotkové komplexy, obsahující proteázy • Hlavní úkol: degradace intracelulárních proteinů • Výskyt: jádro a cytoplazma u eukaryotních buněk

3. 1.1 Hlavní funkce • Odstraňují abnormální proteiny z buňky • Podílejí se na reakcích na stresové situace degradací proteinů, označených ubikvitinem (Ub) • Jako součást Ub systému se zapojují do regulace buněčných procesů • Kontrolují diferenciaci buněk (degradují transkripční faktory a metabolické enzymy) • Velkou roli hrají v imunitním systému, kde vytváří peptidy MHC glykoproteinů I. třídy

4. 1.2 Proteinová degradace • Nově objevený mechanizmus buněčné regulace • Hlavní výhoda proteolýzy – rychlost, umožňující buňce rapidní redukci hladiny určitých proteinů • Nevratný děj – kompletní ztráta funkcí • Základní požadavek: vysoká specifita

5. 1.3 Ubikvitinace • Nejobecnější způsob označování proteinů k degradaci v proteazomech • Připojení řetězce ubikvitinu o 76 aminokyselinách • Katalýza: - E1 aktivující enzymy - E2 konjugační enzymy - E3 vazebné enzymy (pouze v některých případech)

6. Proces degradace s ubikvitinem: Ubikvitin je aktivován vytvořením thiosterové vazby s aktivačním enzymem E1. Ubikvitin je pak přenesen do aktivní cysteinové skupiny konjugačního enzymu E2, který ubikvitin naváže na aminoskupinu zbytku lyzinu substrátového proteinu. Pro tento proces je v některých případech nutná kooperace s enzymem E3. Opakovaná konjugace ubikvitinu s lyzinovými zbytky vede ke vzniku multiubikvitinových řetězců, které, navázané na substrátový protein, jsou rozeznány a degradovány v proteazomech. Multiubikvitinový řetězec se uvolní z komplexu a ubikvitin je recyklován.

7. 1.4 Struktura proteazomu • 2 části: • 20S proteazomjádrem větší částice 26S proteazomu • Oba komplexy existují v dynamické rovnováze • Hlavní rozdíl: 26S proteazom degraduje ubikvitinované proteiny, 20S proteazom ne => 26S proteazom využívá ATP • Přídavná část – 19S víčka- slouží k zachycení a přitáhnutí označeného proteinu do proteazomu

8. 1.5 Funkce 26S proteazomu Plní životně důležité funkce: • kontrola buněčného cyklu • buněčná diferenciace • regulace metabolických drah • role ve stresových situacích • odstraňování abnormálních proteinů

11. Obr.: Proteazom na gelu a v elektronovém mikroskopu

12. 2. Proteazom a viry • Ke konci 90. let bylo objeveno, že onkoprotein E3 lidského papillomaviru vede k proteazomové destrukci proteinu p53, který tlumí tvorbu a vývoj nádoru • O desetiletí později se ukázalo, že zmnožení virových proteinů je určující pro proteolytickou degradaci proteinů hostitelské buňky • Tyto aktivity jsou nutné pro mnoho různých aspektů životního cyklu virů od vstupu do buňky, přes replikaci a zmnožení,až po opuštění buňky virem

13. 2.1 Vstup viru do buňky • Vstup viru do buňky – různé překážky, např. imunitní dohled, zablokování buněčného cyklu v důsledku virové replikace, sebevražedná apoptická smrt buňky • Jedna ze společných překážek – obrovská stechiometrická nerovnováha cílových proteinů hostitele =>mnoho virů vyvinulo mechanizmy, pomocí nichž jsou buněčné cílové proteiny směřovány do 26S proteazomu a vystaveny proteolytické degradaci

14. 2.2 Označení cílových proteinů • Vysoce specifický proces • Nejčastěji využití E3 ubikvitin ligázy - může být kódována přímo virem nebo může být ligázou hostitelské buňky, která byla přesměrována do substrátu • Tak mohou být rozpoznány substráty, které by za normálních okolností nebyly rozeznány

15. Degradace proteinu označeného ubikvitinem a společné body vstupu viru do buňky • Ve většině případů virus zasahuje v kroku E3 ubikvitin ligázy. Ta může být kódována virem nebo může být buněčnou ligázou, která je buď přesměrována, nebo stimulována jiným virovým proteinem. Intenzivně ubukvitinovaný cílový protein je pak degradován v proteazomu.

16. Příklady využití ubikvitin ligáz • Lidský papillomavirus (HPV) – obsahuje E6 protein, který stimuluje ubikvitinizaci a degradacibuněčného proteinu, potlačujícího nádorové bujení = protein p53 • virus stomatitidy, virus vztekliny – interakce jejich matrix proteinů s buněčnou ubikvitin ligázou Nedd4 (při opuštění buňky virem) – neznámý mechanizmus • virus Epstein-Barrové- virový membránový protein 2a přesměruje aktivitu Nedd4 => označení B-buněčných tyrozin kináz k degradaci v proteazomu=> změna signalizace B-buněčných receptorů => vznik latentní virové infekce

17. 3. Modelové situace3.A HPV vs protein ICP0 • Herpes virus simplex (HSV-1) => protein ICP0 - jeden z prvních virových proteinů, který se projevuje při reaktivaci z latence • Aktivita ICP0 je závislá na své lokalizaci v jaderné struktuře, známé jako ND10 • Přítomnost ICP0 vede k degradaci dvou hlavních ND10 komponent -antigenu promyelocytické leukémie (PML) a Sp100 - a tím k rozpadu ND10(někdy pod názvem POD)

18. Nutný aspekt pro funkci ICP0 proteinu – RING-fingers(Really Interesting Gene) na N-terminálním konci • RING-fingers usnadňují transfer ubikvitinu (nebo molekul jemu podobných) z E2 enzymu na heterologní substráty • Proteiny obsahující RING-fingers vytváří největší známé třídy E3 ligáz a objevují se v mnoha buněčných procesech

19. Ztráta funkcí RING-prstů - devastující efekt na většinu aktivit proteinu • Přesto zůstává zachována C-terminální část, která obsahuje jaderný lokalizační signál (NLS) a vazebnou stranu pro ubikvitin specifickou proteázu USP7 • USP7 se zapojuje do deubikvitinace a stabilizace p53 =>oddělení tohoto proteinu od ICP0 může být důvod změny aktivity p53 • Mj. cílovými proteiny ICP0 jsou katalytické podjednotky DNA-PK a dva proteiny centromer CENP-A a CENP-C

20. ICP0 může takévázat a stabilizovat cyklin D3a přemísťovat ho do ND10 • To způsobuje tvorbu aktivního komplexu cyklinu D3 a cyklické dependentní kinázy 4 (cdk4), kterýfosforyluje pRb supresor tumoru => podpora progrese G1 fáze • Jedna z funkcí tohoto komplexu je podporovat ubikvitinaci a degradaci cyklinu D1 • D cykliny jsou normálně uplatněny v podpoře přechodu buněčného cyklu přes G1 až S fáze, takže další vysoké hladiny těchto proteinů by pravděpodobně držely hostitelskou buňku ve stavu replikační pohotovosti, což je ideální prostředí pro replikaci geonomu viru

21. Shrnutí modelu (HPS)-1 vs ICP0 • ICP0 tedy interaguje s 26S proteazomem dvěma způsoby: RING-prsty se uplatňují jako E3, což vede k degradaci komponent ND10 a centromer, a tím k napomáhání virové transkripci • Doména C-terminálního konce působí jako pseudo-E3, kompetitivně inhibující proteazomální degradaci cyklinu D1, což podporuje buněčné prostředí, které je prospěšné virové replikaci DNA

22. •Infekce virem Herpes simplex (HSV-1) - buněčný protein ICP0 navozuje degradaci PML a Sp100, zprostředkovanou interakcí E2 enzymu (UbcH5a/H6) s RING sekvencí • C-terminální polovina ICP0 také interaguje s další součástí enzymu E2 cdc34, která je obsažena v D1 cyklinu • ICP0 stabilizuje D cykliny, díky čemuž se může chovat jako pseudo-E3 enzym

23. 3.B Adenovirus vs E4-orf6-E1B55k-cullin komplex • V buňce infikované a transformované adenovirem je hladina p53 snížena • Důvodem - asociace virových proteinů E155K a E4orf6 proteinu s p53 • E155K a E4orf6 se vážou na p53 svými N a C konci, a naopak, cože vede k proteazom dependentní redukci délky života proteinu p53 na polovinu

24. Systém využívá von Hippel-Lindau (VHL) tumor-supresorového komplexu • Jeho součástí - Elongin BC, na který se váže E4orf6 protein, a rodina látek zvané culliny a Rbx1 • Celý komplex = E2 ubikvitin ligáza, která je posilována E1B55K s cílem degradace p53 zprostředkované proteazomem

25. • Ubikvitin ligázový komplex E1B55K-E4orf6-cullin navozuje degradaci p53 tumor-supresorového proteinu • E1B55K a E4orf6 se oba přímo vážou na p53

26. 4. Závěr • Užití proteazomu různými virovými proteiny zdůrazňuje centrální důležitost buněčných cest pro mnoho úspěšných virových infekcí. • Za normálních podmínek by tumor-supresorový protein p53 zastavil abnormální proliferacibuněk a/nebo navodil apoptózu, přesto v některých situacích dochází k transformacím a malignitám. • Hlavními cíly je prozkoumat a využít degradační strategie virů v terapii rakoviny a antivirové terapii celkově.