TEMA 3. Algunas aplicaciones de la biotecnología genética a la biotecnología alimentaria

1. TEMA 3. Algunas aplicaciones de la biotecnología genética a la biotecnología alimentaria 1- Diagnóstico de patologías hereditarias con repercusión sobre la cantidad o calidad de los productos 2- Detección de genes con influencia en la cantidad o calidad de los productos 3- Identificación genética individual, racial o específica 4- Detección de microorganismos en alimentos 5- Detección de transgénicos

2. 1. DIAGNÓSTICO DE PATOLOGÍAS HEREDITARIAS OMIA (Online Mendelian Inheritance in Animals) : Base de datos de genes y enfermedades hereditarias en 137 especies animales

3. Malignant hyperthermia (Phene ID 1193, Group 000621) in Sus scrofa Possible human homologue (MIM number) 145600 180901 Symbol PSS Cross Species Summary Malignant hyperthermia. A progressive increase in body temperature, muscle rigidity and metabolic acidosis, leading to rapid death. Summary In pigs, malignant hyperthermia (MH) leads to rapid post-mortem changes in muscle, resulting in pale soft exudative (PSE) meat. MH can be triggered by a minor stress, such as loading, transport, sexual intercourse, high ambient temperature, or exposure to the anaesthetic halothane. Susceptibility to halothane-induced MH is an autosomal recessive trait in pigs. Together, sudden death syndrome and PSE constitute porcine stress syndrome (PSS), which became a major economic problem in many countries in the 1970s. In part, this was due to strong selection for increased leanness, which is associated with susceptibility to PSS. In 1991, a major breakthrough occurred when a Canadian research team led by David MacLennan (Fujii et al., 1991) showed that MH is due to a base substitution (C-T) in the 1843rd nucleotide of the gene for the calcium release channel in the sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle. The base substitution causes an amino-acid substitution (arginine - cysteine) in the 615th position of the calcium release channel, resulting in altered calcium flow. A PCR genotyping test based on the causative mutation has been used extensively in many countries, leading to the elimination of the mutation from many herds. Species Specific NamePorcine Stress Syndrome Genetic Test Various PCR genotyping tests have been devised, all based on detection of an RFLP resulting from the causative base substitution. Single Locusyes Characterised at a molecular levelYes

4. SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS) El Síndrome Estrés Porcino (PSS) es una enfermedad hereditaria, que presenta un modelo de herencia recesiva SINTOMAS Taquicardia Rigidez muscular Aumento progresivo de la temperatura corporal Muerte LESIONES Hipertrofia muscular Edema pulmonar CARNES PSE (pale, soft, exhudative)- palidas, blandas y exhudativas- CARNES DFD (dark, firm, dry) – dura, seca y oscura

5. CARACTERÍSTICAS CARNES EN ANIMALES CON PSS

6. DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS) Mutación en el gen de RYR-l: Receptor de la ryanodina- Gen para la liberación del calcio en el músculo esquelético - Sustitución C-T en el nucleótido 1843 Sustitución arginina–cisteina en al posición 615 C/C: Individuos sanos y no portadores C/T: Individuos sanos y portadores T/T: Individuos enfermos

7. DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO PCR/RFLPs 199bp PCR 199bp Alelo C 165bp 34bp Alelo T BsiHKA I

8. Existen genes que determinan el sexo y que tiene una secuencia distinta en machos o en hembras Importante determinar el sexo del embrión para los programas MOET = ovulación múltiple y transferencia de embriones, pero también el origen de determinados productos en los que la características y el valor economico pueden variar según el sexo 2- Detección de genes con influencia en la cantidad o calidad de los productos

9. Más genes interesantes… GENES RELACIONADOS CON LA GRASA DAGT 1 en vacuno: tiene una gran influencia en la cantidad de grasa en la leche A G G A grasa en la leche Grasa en la leche SI ANALIZAMOS EL ADN DE LOS INDIVIDUOS PODREMOS SELECCIONAR DIRECTAMENTE POR EL GENOTIPO

10. HAY OTROS GENES DE INTERES RELACIONADOS CON CARACTERES PRODUCTIVOS K-Caseína - mayor rendimiento en la producción de queso IGF2 – Desarrollo muscular y depósitos grasos RYR 1 – Desarrollo muscular e hipertermia maligna Síndrome de estrés porcino (SSP) PRKAG 3 – Aumenta la cantidad de glucógeno del músculo en un 70% y el desarrollo muscular MIOSTATINA –Hipertrofia muscular o doble musculatura

12. GEN DE LA MIOSTATINA PERDIDA DE FUNCIÓN DEL GEN GENERA UN FENOTIPO SIMILAR EN LAS TRES ESPECIES DE MAMÍFEROS Hipertrofia muscular “ CULONES “ - mayor rendimiento a la canal - mayor proporción de músculo - menor proporción de hueso - mucha menor proporción de grasa Fotografías obtenidas de Genome research (Womack, 2005)

13. 3. IDENTIFICACIÓN GENÉTICA AUTENTIFICACIÓN TRAZABILIDAD En ambos casos se trata de utilizar los marcadores del DNA con diferentes propósitos: 1.- Identificación individuos en diferentes etapas del proceso productivo (de la granja a la mesa)- Verificación de otros sistemas de identificación- Sistema trazabilidad 2.- Identificación de origen genético (raza). Verificación denominaciones de origen o marcas de calidad 3.- Identificación de especies. Identificación de especies en mezclas o sustituciones

14. Seguridad alimentaria PREOCUPACIÓN CRECIENTE ENTRE LOS CONSUMIDORES Crisis de las vacas locas, listeriosis, dioxinas, etc OBLIGATORIEDAD DE ESTABLECIMIENTO DE UN SISTEMA DE TRAZABILIDAD

15. “Establecimiento de un sistema que permita identificar un animal y poder llevar a cabo el seguimiento de sus movimientos a lo largo de toda su vida desde el nacimiento hasta la llegada de su carne hasta el consumidor” ¿ Qué significa TRAZABILIDAD ?

16. FUNDAMENTO: Los animales presentan diferencias en su ADN, a excepción de los gemelos monocigóticos o los clones. SISTEMA FIABLE Y REPETIBLE Como media, 1 de cada 1000 bases del ADN (de los 3.000.000.000) es diferente entre animales La información genética contenida en las células es igual en todas las partes del cuerpo del animal y no varía con el tiempo Sistema de trazabilidad genética Sistema basado en el análisis del ADN Marcadores utilizados : MICROSATÉLITES SNPs

17. IDENTIFICACIÓN DE ORIGEN RACIAL CONTROL DE CALIDAD Ejemplo: productos derivados de cerdo ibérico (UTILIZACIÓN DE MARCADORES ESPECÍFICOS DE RAZA) ANÁLISIS DE LOS GENES MC1R Y Pink PCR/RFLPs MC1R- Receptor de la melanocortina 1 Genes que determinan el color de la capa Pink MC1R y Pink presentan alelos fijados en la raza Duroc que no aparecen en poblaciones de cerdo ibérico Datos obtenidos de Fernández et al 2003

18. IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES Autentificación Razones filosóficas y religiosas > Demanda de productos de calidad Cuestiones legales Fraudes económicos

19. Identificación de especies mediante RAPDs Aplicable a la detección de fraudes en patés C/Pt Pt O Pv Pll C Pt

20. Identificación de especies mediante RAPDs Aplicable a carne o a quesos 750 pb 340 pb 310 pb 290 pb Caprino Ovino Bovino

21. Identificación de especie mediante amplificación de fragmento específico de porcino ( Patente LAGENBIO- Universidad de Zaragoza ) b o cp cv pll pv pt e - Muestras sanguíneas de diferentes especies- solamente se amplifica en cerdo

22. Pietrain Chato Murciano Landrace Large White AMPLIFICACIÓN DEL FRAGMENTO ESPECÍFICO DE CERDO EN DIFERENTES RAZAS

23. 1% 5% 10% 25% 50% 75% 100% Cuantificación Nos permite demostrar no solo que hay presencia de cerdo, sino en que proporción en una mezcla.

24. CASO PRACTICO.Identificación de especies por sustitución • Denuncia de venta de cordero en lugar de cabrito en Navidad 08 • Utilización de RAPDs • Recepción en el laboratorio: muestra de carne Muestra problema Muestra problema Cabra 1 Cabra 2 Oveja 1 Oveja 2 vaca SOLUCIÓN: LA MUESTRA PROBLEMA ES CORDERO Y NO CABRITO

25. 4.- DETECCIÓN DE MICRORGANISMOS EN ALIMENTOS • Imprescindible en la Seguridad alimentaria • - En los Estados Unidos se dan aproximadamente 76 millones de casos de intoxicación alimentaria (26.000 casos por cada 100.000 habitantes),5 de los que: • 350.000 son hospitalizados (111 por 100.000 hab.) • 5.000 mueren (1,7 por 100.000 hab.) • - Salmonella , Listeria , Toxoplasma, Campilobacter, E.coli O157 son los agentes màs frecuentes en las infecciones causadas por alimentos

26. Tests genéticos aplicados a la detección de microorganismos - Se aplica la técnica de PCR - Se basa en la identificación de un fragmento de DNA específico del microrganismo contaminante

27. Bacterias en alimentos pueden ocasionar grandes pérdidas económicas • Deterioran los alimentos • Origina enfermedades en consumidores por su dificultad de eliminación • VENTAJAS • Sensibilidad • Especificidad • Capacidad de procesamiento de gran número de muestras

28. DENTRO DEL PRIMER GRUPO (deterioran los alimentos): Detección rápida de bacterias productoras de exopolisacáridos del tipo beta-glucano. El uso de este método podría permitir la prevención del ahilamiento de bebidas alcohólicas en el que están implicados estos polisacáridos (especialmente la sidra). Detección gen gtf mediante PCR DENTRO DEL SEGUNDO GRUPO (causan enfermedades)

29. Microrganismos Trastorno Posible producto Método que ocasiona portador Carne de aves Arroz, prod. Lacteos Y cárnicos Aves, cerdo , res y Leche cruda Pescado, miel, latas Carne de res y aves, Salsas Carne y productos Lácteos Pate, leche, queso, carne Mariscos, ensalada de col Leche, huevo crudo, carne de res y ave Mayonesa, vegetales crudos Leche y aves Ostras crudas, pescado Leche, tofu, canales de cerdo Acrobacter spp Bacillus cereus Campilobacter spp Clostridium botulinum Clostridium perfringens E.Coli Listeria spp Salmonella spp Shigella spp Vibrio cholera Yersinia enterocolitica Diarrea Diarrea, vómitos Diarrea Botulismo, vómitos Diarrea, dolor abd. Diarrea, colitis Listeriosis Gastroenteritis Fiebre , calambres Cólera Yersiniosis RAPD-PCR PCR PCR múltiple PCR anidado PCR duplex PCR múltiple RT- PCR PCR-múltiple RT- PCR RT- PCR PCR simple RT- PCR RT- PCR

30. EXISTEN KITS COMERCIALES BAX (Qualicom, USA) Salmonella Listeria E.Coli O157:H7 PROBELIA (Sanofi, France) Salmonella Listeria TAQMAN (Perkin Elmer, USA) Salmonella Listeria E.Coli O 157

31. VENTAJAS DE LA TÉCNICA DE PCR EN LA DETECCIÓN DE PATÓGENOS - Rapidez - Simplicidad (disponibilidad de Kits comerciales) - Alta sensibilidad ( permite diferenciar cepas) - PCR cuantitativo permite la cuantificación del nivel de patógenos

32. PCR - - + + + + + Presencia de banda - Diagnóstico + Ausencia de banda - Diagnóstico -

33. 5.- Detección de transgénicos ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO (Directiva 2001/18/CE) Cualquier organismo, con excepción de los seres humanos, cuyo material genético ha sido modificado de una manera que no se produce de forma natural en el apareamiento ni en la recombinación natural

34. ETIQUETADO • La UE “reconoce el derecho de los consumidores a la información y el etiquetado como herramienta para una elección responsable” • La obligatoriedad del etiquetado se regula en los reglamentos 1829 y 1830 / 2003 del Reglamento Europeo y del Consejo de 22 de Septiembre de 2003 • - El etiquetado indicando la presencia de un OMG es obligatorio en todos los casos y sin depender de la cantidad de OMG presente

35. Genética Creación de plantas transgénicas Detección de transgénicos en una mezcla con una sensibilidad 0,1% Mediante técnica PCR Aplicación a la verificación de etiquetas, seguimiento y detección de fraudes

36. DETECCIÓN POR PCR DE MAÍZ TRANSGÉNICO