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Producción de proteínas recombinantes en cél eucariotas

Producción de proteínas recombinantes en cél eucariotas. Problemas que suelen aparecer cuando proteínas eucarióticas se expresan en cél procariotas inestables sin actividad biológica contaminantes procarióticos. Sistemas de expresión eucariotas.

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Producción de proteínas recombinantes en cél eucariotas

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Presentation Transcript

  1. Producción de proteínas recombinantes en cél eucariotas • Problemas que suelen aparecer cuando proteínas eucarióticas se expresan en cél procariotas • inestables • sin actividad biológica • contaminantes procarióticos

  2. Sistemas de expresión eucariotas • Para eliminar los problemas de expresión en procariotas, se han desarrollado sistemas de expresión eucariotas • Esp. importantes para proteínas terapéuticas • Necesidad de que tengan idénticas propiedades a la proteína natural : bioquímicas biofísicas funcionales

  3. Sistemas de expresión eucariotas • Cuál es la diferencia? • Modificación post-traduccional de la mayoría de las proteínas eucariotas • Cél procariotas no pueden realizar estas modificaciones

  4. Modificaciones post-traduccionales • Formación de uniones disulfuro correctas • Clivaje proteolítico del precursor inactivo • Glicosilación- agregado de residuos de azúcar • Alteración de aminoácidos en la proteína • fosforilación • acetilación • agregado de grupos sulfato • Agregado de ácidos grasos

  5. Sistemas de expresión en levaduras: ventajas • Organismo unicelular • Bien caracterizadas genética y fisiológicamente • Promotores fuertes disponibles • Plásmido natural (2µm) • Eucariotas, ocurren modificaciones post-transduccionales • Segregan algunas proteínas • No patógeno

  6. Vectores de levaduras • YIp: integrativos • - una copia integrada a un cromosoma • YEp: episomales • - ori 2m (alto número de copias) • YCp: centroméricos • ARS, CEN (1 o 2 copias por cél) • Todos tienen marcador de auxotrofia y son shuttle

  7. Vectores episomales • Son ampliamente usados • A menudo inestables en cultivos a gran escala (>10L) • Estrategia - alterar las condiciones de crecimiento para estabilizar el vector episomal • usar cepas mutantes que requieren nutrientes específicos. • Leucina, Triptofano, Histidina • el gen que provee el fenotipo salvaje se encuentra en el plásmido episomal

  8. Promotores de levaduras Promoter Status Acid phosphatase PHO5 Inducible Alcohol dehydrogenase I ADH I Constitutive Alcohol dehydrogenase II ADH II Inducible Galctokinase GAL 1 Inducible Metallothionein Cup 1 Inducible Phosphoglycerate kinase PGK Constitutive Triose Phosphate isomerase TPI Constitutive

  9. Sistemas de expresión en levaduras: desventajas • Inestabilidad de plásmidos en gran escala • Vectores episomales • Superglicosilación de glicoproteínas • 100+ residuos manosa vs. 8-13 normal • puede alterar la actividad de la proteína • Proteínas secretadas quedan atrapadas en periplasma (entre la membrana y la pared celular) • se usan señales peptídicas

  10. Soluciones a los problemas en sistemas de expresión en levaduras • Levaduras modificadas genéticamente para llevar a cabo glicosilación = humanos • Science Vol 301, p1244-1246 (29 Aug 2003) • Deleción de genes de glicosilación de levaduras • Agregado de genes de glicosilación humanos

  11. Soluciones a los problemas en sistemas de expresión en levaduras • Usar otro tipo de levaduras • Pichia pastoris • Hansenula polymorpha • No sólo Saccharomyces cerevisiae • Usar otros eucariotas • Cél de insectos • Cultivos de cél de mamíferos

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