DNA replikatsioon ja transkriptsioon

1. DNA replikatsioon ja transkriptsioon

2. DNA replikatsioon- geneetilise informatsiooni säilitamine • DNA polümeraasid • DNA kahjustused ja reparatsioon • RNA süntees- transkriptsioon • RNA modifitseerimine

3. DNA replikatsioon DNA replikatsiooni korral kasutatakse üldjuhul mõlemat DNA ahelat informatsiooni lugemisel matriitsina DNA replikatsioon on semikonservatiivne Iga uus DNA ahel koosneb ühest originaalahelast ja ühest uuest ahelast Semikonservatiivne replikatsiooni mehhanism on universaalne

4. DNA replikatsioon DNA replikatsioon algab diskreetsetes kohtades, mida nimetatakse replikatsiooni alguspunktis (origin of replication) ja kulgeb bidirektsionaalselt, tekivad replikatsiooni mullid Struktuur, mis moodustub sünteesilookuse juures, kus 2-ahelaline DNA läheb üle 1-ahelaliseks, kannab nimetust replikatsiooni kahvel Replikatsiooni kahvleid jälgis esimesena 1950 aastate lõpul John Cairns Eukarüootsetel kromosoomidel, kus DNA on lineaarne, toimub initsiatsioon mitmes lookuses. Replikatsioon kulgeb bidirektsionaalselt

5. DNA polümeraasid- DNA sünteesi katalüüsivad ensüümid DNA polümeraas I Avastamisjärjekorras esimene ensüüm, mis katalüüsib DNA sünteesi dNTP + (dNMP)n (dNMP)n+1 + PPi Mg2+ dNTP – nukleosiid trifosfaadid dATP, dCTP, dGTP, dTTP (dNMP)n+1 - sünteesitud DNA pikkusega n+1 (dNMP)n - sünteesitud DNA pikkusega n PPi - pürofosfaat

6. DNA polümeraas I Mg2+ - obligatoorne kofaktor, moodustab kompleksi nukleotiidiga Reaktsioon suunatud polümerisatsiooni suunas tänu pürofosfaadi edasisele hüdrolüüsile Matriitsivaba polümerisatsiooni ei toimu- vajalik DNA ahel, millele toimub süntees De novo süntees ei toimu- on vajalik praimer koos vaba 3´ hüdroksüüliga, kuhu kinnitub uus nukleotiid Ahela pikenemine- elongatsioon- toimub 3´ otsas ja kulgeb 5´- 3´suunas

7. DNA polümeraas II ja III E. colis on avastatud teised polümeraasid Reaktsiooni tingimuste osas sarnased nõudmised Põhiline replikatiivne polümeraas on DNA polümeraas III Teised polümeraasid on eelkõige DNA defektide parandamiseks I II III Molekulmass 103,000 88,000 900,000 Polüpeptiidahelaid 1 4 10 Polümerisatsiooni 16-20 7-8 250-1000 kiirus (nt/s) Ensümaatiline aktiivsus 3´- 5´ eksonukleaas ja ja ja 5´- 3´ eksonukleaas ja ei ei

8. Okazaki fragmendid Kõik tuntud DNA polümeraasid katalüüsivad ahela pikendamist 5´Z 3´ suunas 2 DNA ahelat replitseeritavas molekulis on orienteeritud erinevates suundades Ainult ühte ahelat on seega võimalik sünteesida pidevana 5´Z 3´ kahvli liikumise suunas Komplementaarse ahela süntees peab toimuma samuti 5´Z 3´ suunas, ent see on võimalik vaid fragmentide kaupa. Neid fragmente nimetatakse Okazaki fragmentideks Vastavalt ahela sünteesile eristatakse juhtivat (leading) ja juhitavat (lagging ) ahelat. Okazaki fragmendid ühendatakse kovalentselt sünteesijärgselt.

9. DNA replikatsioon Kromosoomaalse DNA replikatsioon on paljude valkude osalusel toimuv kompleksne protsess ka lihtsamates prokarüootsetes rakkudes Helikaas ATP sõltuv DNA kaksikheeliksi lahtiharutamine DNA güraas DNA topoloogia muutmine SSB valgud Üksikahelalise DNA stabiliseerimine Primaas RNA praimeri süntees DNA polIII replikatiivne polümeraas DNA polI RNA praimeri eemaldamine ja tühiku täissüntees DNA ligaas Viimase Okazaki fragmentide vahelise fosfoestri süntees

10. Prokarüootne kromosoomi replikatsioon Esimene etapp Helikaas- ori kompleksi moodustumine. Helikaas assotseerub replikatsiooni ori-ga tavaliselt tänu nn. initsiaatorvalkude kompleksile, mis esmalt ori ära tunnevad. Helikaas katalüüsib DNA ahelate separatsiooni DNA güraas assisteerib protsessil aidates kõrvaldada tekkivaid torsionaalseid pingeid. Moodustub replikatsioonikahvel

11. Prokarüootne kromosoomi replikatsioon Teine etapp Eksponeeritud üksikahelalised DNA lõigud stabiliseeritakse ja fosfodiestersidemed protekteeritakse nukleaaside toime eest Protektsioon saavutatakse SSB valgu abil, mis moodustab spetsiifilise kompleksi üksikahelalise DNA-ga Sellega on lõppenud DNA sünteesi ettevalmistav osa

12. Prokarüootne kromosoomi replikatsioon Kolmas etapp Primaas sünteesib lühikese 4-10 nukleotiidi pikkuse RNA molekuli Juhtival ahelal on primaasi funktsioon vajalik ainult üks kord. Iga Okazaki fragment peab algama uue RNA praimeriga- primaas peab sellel ahelal töötama korduvalt Sellega on loodud eeldused DNA polümeraas III funktsiooniks

13. Prokarüootne kromosoomi replikatsioon Neljas etapp DNA polümeraas III kasutab RNA praimeri 3´- hüdroksürühma selleks et alustada protsessiivset DNA sünteesi Juhtiva ahela süntees järgib replikatsioonikahvli liikumist Juhitava ahela süntees liigub vastupidises suunas ja seiskub teise Okazaki fragmendiga kohtumisel

14. Prokarüootne kromosoomi replikatsioon Viies etapp RNA praimerid eemaldatakse DNA polümeraas I 5´- 3´ suunalise eksonukleaasse aktiivsuse poolt Järelejäänud tühikud sünteesitakse täis DNA polümeraas I poolt

15. Prokarüootne kromosoomi replikatsioon Kuues etapp DNA ligaas sünteesib viimase fosfodiestersideme Okazaki fragmentide vahel Replikatsioon termineerub tsirkulaarse E. coli kromosoomi korral kahe vastassuunalise kahvli kohtumisel

16. Eukarüootne replikatsioon Tunduvalt keerukam protsess, aktiivselt uuritav Mõningaid erinevusi Replikatsiooni initsiatsiooni mehhanism oluliselt erinev. Initsiatsioon kontrollitud rakutsüklis välistades sama ori teistkordse kasutamise samas S-faasis Kromosoomi otstes paiknevad telomeerid, mis koosnevad lühikeste järjestuste sadadest kordustest Inimesel telomeer- heksanukleotiid AGGGTT

17. Eukarüootne replikatsioon Telomeraas Telomeraas on ensüüm, mis katalüüsib kromosomaalse DNA otste sünteesi eukarüootsetes rakkudes Telomeraas on ribosüüm, mille koosseisu kuuluv RNA on ühtlasi DNA sünteesil kasutatavaks matriitsiks Telomeraasi aktiivsuse muutused võivad olla olulised rakkude jagunemise ja vananemise regulaatorid

18. DNA kahjustused ja reparatsioon Mutatsioon- originaalse DNA järjestuse muutus Lihtsaim mutatsioon- punktmutatsioon insertsioon deletsioon Mutatsioon võib olla kahjulik/letaalne rakule, harva esineb positiivse efektiga mutatsioone Mutageen- keemilised või füüsikalised mõjurid, mille tulemusena mutatsioonid tekivad

19. Mutatsioonid Spontaansed mutatsioonid- muutused, mis toimuvad normaalsete metaboolsete ja geneetiliste funktsioonide korral • Valede desoksüribonukleotiidide lülitumine sünteesitava DNA koosseisu replikatsiooniprotsessis • Lämmastikaluste modifitseerumine hüdrolüütiliste reaktsioonide tulemusel Kinnisunud mutatsioonid E. coli replikatsiooniprotsessis on väga haruldased (1:1010 ) Esialgne valede nukleotiidide lülitumise sagedus on palju kõrgem (1:104-105) Reparatsioonimehhanismid korrigeerivad enamiku esialgselt valesti lülitatud nukleotiididest

20. Spontaansed mutatsioonid E. Coli rakkudes on süsteemid, mis võimaldavad detekteerida ja kahjutuks teha valesti paardunud nukleotiide Reparatsioonisüsteemid baseeruvad järgmistel etappidel Endonukleaasiga või sellega assotseerunud valgud tunnevad ära kahjustuse DNA struktuuris Endonukleaas hüdrolüüsib anormaalse struktuuri juures asuva fosfodiestersideme Eksonukleaas kõrvaldab valesti lülitatud nukleotiidi Tekkinud tühik sünteesitakse täis DNA polümeraas I või III poolt DNA ligaas sünteesib viimase fosfodiestersideme

21. Fotodimerisatsioon UV kiirguse toimel võivad kõrvuti asuvad tümiinid moodustada kovalentselt seotud fotodimeere. Selle tulemusena moonutub regulaarne DNA kaksikheeliks, katkevad vesiniksidemed teises ahelas olevate adeniinidega Fotodimeeride parandamiseks seondub spetsiaalne fotoreaktiveeriv ensüüm tümiindimeeriga Ensüümi aktiveerib nähtav valgus, mis taastab esialgse struktuuri ning seejärel vabaneb DNA küljest

22. Indutseeritud mutagenees Rida keskkonna mõjureid indutseerivad mutatsioone- funktsioneerivad kui mutageenid Radiatsioon Ioniseeriv röntgenkiirgus, gamma kiirgus, kosmiline kiirgus UV Keemilised mutageenid Lämmastikaluste modifitseerijad: formaldehüüd, alküleerivad ühendid-DMS, hüdrasiin, lämmastikaluste homoloogid- 2-aminopuriin, 5-bromouratsüül Interkaleerivad substantsid Tüüpiliselt aromaatsed, hüdrofoobsed ja tasapinnalised kemikaalid, mis võivad paigutuda üksteise peal paiknevate lämmastikaluste vahele, põhjustades replikatsioonil deletsioonide või insertsioonide teket

23. RNA süntees- transkriptsioon ja posttranslatsiooniline modifitseerimine Tunne oma keelt! Transkript-RNA molekul, nii nagu DNA korral toimub ka RNA süntees 5´-3´suunas Matriits ahel – eesti keeles template ahel- see ahel, millel baseerub komplementaarse RNA süntees, loetakse 3´- 5´suunas. Kodeeriv ahel- teine ahel, struktuur sama mis RNA-l Esimene nukleotiid transkriptis on +1. Järgmised nukleotiidd tulevad sealt edasi, st +2, +3, ....+113 jne Teisele poole ehk upstream on nukleotiidid –1, -2, -3 jne. Need numbrid on sageli väärtuslikud regulaatorelementide kirjeldamisel. Nukleotiid 0 ei ole olemas.

24. DNA sõltuv RNA süntees Prokarüootsetes rakkudes on üks DNA sõltuv RNA polümeraas, mis osaleb RNA transkriptsiooni kõikide etappide katalüüsil Kogu protsess on jaotatav 3 etappi: initsiatsioon elongatsioon terminatsioon

25. DNA sõltuv RNA süntees Transkriptsioon initseeritakse RNA polümeraasi sidumisega promootori järjestusega DNA ahelal Sellega tagatakse transkriptsiooni regulatsioon Esmaseks tulemuseks on kahe DNA ahela separatsioon

26. DNA sõltuv RNA süntees DNA järjestuses on nn. initsiatsiooni ja terminatsiooni signaalid, mis määravad ära, kus RNA süntees algab ja kus lõpeb Elongatsiooniprotsess toimub niikaua, kuni kogu geen on transkribeeritud. Vastavas protsessis toimuv fosfodiestersidemete süntees on katalüüsitud RNA polümeraasi poolt. Ka see protsess nagu DNA sünteeski on pürofosfaadi hüdrolüüsi tõttu nihutatud paremale. DNA template NTP + (NMP)n (NMP)n+1 + PPi NTP – nukleosiid trifosfaadid ATP, CTP, GTP, UTP (NMP)n+1 - sünteesitud RNA pikkusega n+1 (NMP)n - sünteesitud RNA pikkusega n PPi - pürofosfaat

27. DNA sõltuv RNA süntees Peale terminatsioonijärjestuseni jõudmist vabaneb sünteesitud RNA molekul ja RNA-d sünteesiv kompleks. DNA esialgne struktuur saab taastuda

28. DNA sõltuv RNA süntees eukarüootsetes rakkudes Transkriptsiooni erinevused eukarüootsetes rakkudes: RNA polümeraase on 3 mitte üks nagu prokarüootides Polümeraas I transkribeerib suuri ribosomaalseid rRNA-sid Polümeraas II transkribeerib valke kodeerivaid mRNA-sid Polümeraas III transkribeerib tRNA-d ja väikest ribosomaalset 5S rRNA-d On olemas viirusliku päritoluga ensüümid, mis katalüüsivad RNA sõltuvat RNA sünteesi ja RNA sõltuvat DNA sünteesi.

29. Post-transkriptsiooniline RNA modifitseerimine Primaarne transkript- RNA polümeraasi sünteesi produkt. Tüüpiliselt ei ole primaarsed transkriptid 100% aktiivsed Selleks et RNA võtaks küpse vormi, on vajalikud spetsiifilised modifikatsioonid RNA struktuuris, mis sõltuvad konkreetsest RNA klassist RNA molekuli otste spetsiifiline lühendamine Intronite eemaldamine splaisingu teel (eukarüoodid) Terminaalsete järjestuste lisamine Heterotsükliliste aluste modifitseerimine

30. Pre-tRNA modifitseerimine RNA molekuli otste spetsiifiline lühendamine Intronite eemaldamine splaisingu teel Terminaalsete järjestuste lisamine Heterotsükliliste aluste modifitseerimine

31. mRNA protsessing Prokarüootse mRNA modifitseerimised ei ole ulatuslikud, eukarüootides toimuvad järgmised protsessid: Capping polü(A) lisamine splaising Pre-mRNA modifitseerimine toimub eukarüootse raku tuumas

32. Capping ehk mütsistamine mRNA 5´ otsa modifitseerimine Hüdrolüütiliselt eemaldatakse 5´terminaalse trifosfaadi koosseisust terminaalne fosfaat Guanosiin trifosfaadist liidetakse 5´otsa GMP, nii et tekib 5´-5´trifosfaat Guaniini lämmastikalus metüleeritakse N7 positsioonist Täiendavalt võidakse metüleerida riboosi jääk hüdroksüülrühmast

33. Polü(A) lisamine 3´otsa modifikatsioon Enamus küpsetest mRNAdest sisaldab 3´otsas 20-250 nt pikkust polü(A) saba Esiteks eemaldab eksonukleaas primaarsest transkriptist mõne nukleotiidi Adeniini jäägid lisatakse polüadenüül polümeraasi poolt Polü(A) saba funktsioon arvatakse olevat mRNA stabiilsuse tagamine, kaitse raku nukleaaside hüdrolüütilise toime eest

34. Intronite eemaldamine- splaising Eksonid- kodeerivad fragmendid Intronid-mittekodeerivad fragmendid