第四章 实验室检疫基本知识 一 基于分子生物学技术的快速检测技术 PCR 及衍生技术 ①PCR

1. 第四章 实验室检疫基本知识 一基于分子生物学技术的快速检测技术 PCR及衍生技术 ①PCR 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。http://v.ku6.com/show/jNzCz7VSmh8SwOzC.html http://v.youku.com/v_show/id_XMjE1MDkwNTMy.html

3. ②Direct-PCR 不用核酸提取的PCR技术，直接将细胞加入到PCR体系，通过高温裂解细胞释放核酸作为模版，进行PCR扩增。

4. 即巢式PCR，是指利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。 在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的模板很少）增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。 ③Nested-PCR

6. ④BIO-PCR 平板富集之后挑取可疑菌落的PCR。

8. ⑤膜捕获PCR 利用硝酸纤维素对蛋白的高吸附性，将样品中的细菌吸附后洗脱（或者扩繁）后，进行PCR扩增。

9. ⑥膜过滤PCR 0.22微米微孔滤膜过滤富集细菌后的PCR。

10. ⑦反转录PCR(reverse transcription, RT- PCR)当扩增模板为RNA时, 需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。 另外：反向PCR( Inverse PCR, IPCR)技术、锚定PCR(Anchored PCR, APCR)、不对称PCR(asymmetric PCR)、修饰引物PCR技术、等位基因特异性PCR(Allele- specificPCR, ASPCR)、单链构型多态性PCR(single- strandconformational polymorphism PCR, SSCPPCR)、低严格单链特异性引物PCR (Lowstringencysingle specific primer PCR, LSSP- PCR)、复合PCR(multiplex PCR)、重组PCR技术。

11. LAMP ：2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即LAMP (Loop-mediated isothermal amplification),中文名为“环介导等温扩增反应”，受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，短短几年，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中，在这次甲型H1N1流感事件中，日本荣研化学公司接受WHO的邀请进行H1N1 LAMP试剂盒的研制。

13. 二 基于免疫学的快速检测技术 1 免疫学基础知识 关于抗原

14. 抗原：是指能与淋巴细胞抗原受体特异性结合，刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，并能引起相应免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）在体内、外发生特异性反应的物质。 抗原的两种特性： 免疫原性：是指抗原能刺激机体产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的特性 免疫反应性：是指抗原能与相应免疫应答产物发生特异性结合的特性（也称抗原性）

16. 完全抗原：同时具备免疫原性和免疫反应性的物质。完全抗原：同时具备免疫原性和免疫反应性的物质。 半抗原：仅具备免疫反应性而不具备免疫原性的物质。 半抗原+载体=完全抗原 载体通常为大分子蛋白质 例如：青霉素+血清蛋白=完全抗原。

17. 决定抗原免疫原性的因素： （1）抗原的理化性质： 分子大小---分子量越大，结构越复杂 化学组成---复杂的化学基团（蛋白质和多糖） 抗原表位的易接近性 物理性状：颗粒性抗原＞可溶性抗原，聚合态蛋白＞单体 （2）抗原与机体的相互作用： 异物性---凡与宿主自身成分不同或从未与特异性淋巴细胞 接触过（即使为自身抗原）的物质（首要条件） 机体因素---不同种属对同一抗原的免疫应答有差别。 同一种属内，不同个体由于遗传背景不同对同 一抗原的应答也有差别。 宿主性别、年龄、健康状况、心理状态 抗原进入机体的途径、剂量等

18. 抗原的特异性 一种抗原物质只能刺激机体产生相应的抗体，这种 抗原只能与相应的抗体结合发生反应，称为抗原的 特异性，或称专一性、针对性。 抗原表位、抗原决定簇 抗原物质上能够诱导机体产生应答并与应答产物发 生特异反应的化学基团。 抗原结合价：是指能够与抗体分子结合的决定簇数目。

19. 抗原的交叉性： 交叉抗原：某些特定抗原不仅可与其诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞结合，还可与其他抗原诱导产生的抗体 或致敏淋巴细胞反应，这种抗原叫做交叉抗原。 原因：不同抗原物质表面含有相同或相似的抗原表位

20. 4、抗原的分类： （1）根据抗原性能 完全抗原、半抗原 （2）根据抗原诱生抗体是否需要T细胞辅助 胸腺依赖性抗原 胸腺非依赖性抗原 （3）根据抗原与机体的亲缘关系 异种抗原：病原微生物、疫苗 同种异型抗原：血型抗原 自身抗原： 异嗜性抗原： （4）根据抗原产生方式 天然抗原、人工抗原

21. 抗 体

22. （1）免疫球蛋白与抗体 免疫球蛋白（Ig）：指存在于人和动物血液（血清）、组织液及其他分泌液中的一类具有相似结构的球蛋白。五类：IgE IgD IgM IgA IgG 抗体是机体免疫活性细胞（B淋巴细胞）受抗原刺激后，在血清和体液中出现的一种能与相应抗原发生特异性反应的免疫球蛋白。 所有抗体均为免疫球蛋白，但是免疫球蛋白不一定为抗体。

23. （2）抗体的结构 * 重链*2和轻链*2 * 可变区V（1/4、1/2）和恒定区C（3/4、1/2） V内的高变区—三个氨基酸组成和排序高度可变 V—抗原结合部位 * 铰链区

24. （3）免疫球蛋白的水解片段 木瓜蛋白酶：抗原结合片断：Fab片段---单价，可与抗原结合但不凝集或沉淀反应. 可结晶片段：Fc片段---是Ig与效应分子或细胞相互作用的部位 胃蛋白酶:F（ab’）2---双价，同时结合两个抗原表位，发生凝集和沉淀反应pFc’---被降解

25. （4）免疫球蛋白的分类 IgG：含量最高机体所产生的主要抗体, 唯一可通过胎盘的抗体 IgM： 5个单体分子组成的五聚体 抗感染免疫的早期起着十分重要的作用 IgA: 两个单体由J链连接在一起 IgA对机体呼吸道、消化道等局部免疫起作用 IgE: 单体形式存在，在血液里含量最低 引起I型过敏反应 IgD:极少分泌

26. （5）免疫球蛋白的生物学活性

27. 抗原抗体反应的原理 (1)抗原抗体的亲和力和亲合力 亲和力：是抗体分子上一个抗原结合点与相应的抗原决定簇 之间的相适应而结合的强度，是抗原与抗体间固有的结合力。

28. 亲合力：是指一个抗体分子与整个抗原表位之间结合的强亲合力：是指一个抗体分子与整个抗原表位之间结合的强 度，与抗体结合价直接相关。另外也与亲和力强弱有关。

29. (2) 抗原抗体的结合力 • 不形成牢固的共价键，通过非共价键结合 • 这种弱的结合力涉及几种分子间的作用力 1、静电引力 2、范德华引力 3、氢键 4、疏水作用力

30. 静电引力 抗原和抗体分子带有相反 电荷的氨基和羧基基团之 间相互的引力。称库伦引力。 范德华引力 抗原和抗体相互接近时， 各自所携带的原子与原 子、分子与分子由于分子 极化作用而出现的引力。 作用力最小 范德华引力

31. 氢键结合力 供氢体上的氢原子与受氢体原子间的引力。 疏水作用力（疏水键） 两个疏水基团在水溶液中相互接触时，由于对水分子排斥而趋向聚集的力。结合力最强 疏水作用力

32. 多克隆抗体 采用传统的免疫方法，将抗原物质经不同途径注入动物体内， 经数次免疫后采取动物血液，分离出血清，由此获得的抗血 清即为多克隆抗体 抗原物质进入机体，刺激不同B细胞产生的针对不同抗原决 定簇的多种抗体混合物。 针对同一抗原决定簇的抗体仍是由不同B细胞克隆产生的不 同质的抗体组成。

33. 1 1 2 2 3 3 4 4 抗 原 免 疫 脾 脏 淋巴結 B 細胞 1 2 3 4 传统抗血清 所有抗体混合

34. 单克隆抗体 单克隆抗体是指由一个B细胞分化增殖的子代细胞（浆细胞） 产生的针对单一抗原决定簇的抗体。 这种抗体的重链、轻链及其V区独特型的特异型性、亲和力、 生物学性状及分子结构均完全相同。 这种杂交瘤细胞既具有骨髓瘤细胞无限繁殖的特性，又具有 B细胞分泌特异性抗体的能力，由克隆化的B细胞杂交瘤所产 生的抗体即为单克隆抗体

36. 1.ELISA的原理 2.ELISA的类型 3.　试剂准备：免疫吸附剂 结合物 酶底物的准备 4.　对照设定 5.　标本的采取和保存 6.　结果判断

37. 1.ELISA的原理 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 。

38. ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA） 。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。 http://video.sina.com.cn/v/b/9504616-1428392121.html

39. 酶免疫测定类型 酶免疫组化 酶免疫技术 固相酶免疫测定 酶免疫测定 液相酶免疫测定 这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA。

40. 1.1　抗原抗体反应 1.1.1　可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为： Ag+Ab→Ag·Ab 抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab] ,Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。

41. 1.1.2　特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。 测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。

42. 1.1.3　最适比例

43. 1.1.4　敏感性 化学比色法的敏感度为mg/ml水平 酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml 免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿 标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平 例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。

44. 1.4　免疫测定在临床检验中的应用 由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。

45. 2ELISA的类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂： （1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）； （3）酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法。

46. 2.2.1　双抗体夹心法测抗原 此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。

47. 2.2.2 双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。

48. 2.2.3 间接法测抗体 传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

49. 2.2.4 竞争法测抗体 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。

50. 2.2.5 竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。