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Jean-Luc Teillaud (Equipe 14 « Biotechnologie des Anticorps »,

Anticorps monoclonaux à usage thérapeutique:  optimisation, nouveaux formats et défis technico-économiques. Jean-Luc Teillaud (Equipe 14 « Biotechnologie des Anticorps », Centre de Recherche des Cordeliers/INSERM U.872) jean-luc.teillaud@crc.jussieu.fr.

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  1. Anticorps monoclonaux à usage thérapeutique: optimisation, nouveaux formats et défis technico-économiques Jean-Luc Teillaud (Equipe 14 « Biotechnologie des Anticorps », Centre de Recherche des Cordeliers/INSERM U.872) jean-luc.teillaud@crc.jussieu.fr

  2. Publication de la technique d’obtention des anticorps monoclonaux (AcM): Köhler & Milstein, Nature, 256: 495, 1975 Premier AcM mis sur le marché (1986) : Muromonab (anti-CD3, souris) Derniers AcM mis sur le marché (2011) : ipilimumab (anti-CTLA-4), belimumab (anti-BLyS/BAFF) * 27 AcM ont actuellement une AMM [ USA (FDA) et Europe (EMA)] Les anticorps monoclonaux: 37 ans d’Histoire

  3. Lymphocyte B Hybridome ARNt/ARNm VL VH ADNc Génération d’un AcM recombinant huIgG,  AcM, HuIgG, Vecteur(s) avec séquences huC et huC Transfection Clonage Lignée cellulaire (CHO, NS1…)

  4. VH VH Fab VL VL CH1 CH1 CL CL Fixation au FcRn CH2 CH2 Fc Fixation aux FcR CH3 CH3 Fixation à l’Ag Dualité fonctionnelle des anticorps (IgG1)

  5. Neutralisation de l’interaction ligand soluble-récepteur (Ac anti-ligand, anticorps anti-récepteur): TNFa, IL1b, VEGF, IL6-R, EGF-R, CD25 (IL2-Ra), FceRI, toxine (charbon), C5 • Blocage de l’activation d’un récepteur (HER2/Neu, EGF-R) • Blocage de l’interaction cellule-cellule (CD11a, intégrine a4) • Induction d’apoptose (CD20) • Ciblage d’une drogue (CD33-ozogamicine*) • * Retiré du marché Modes d’action des AcM à usage thérapeutique

  6. Activation de mécanismes effecteurs via la région Fc (ADCC, CDC, phagocytose, production de cytokines ou/et de chimiokines) (CD20, CD52) • Induction d’une immunomodulation par blocage de molécules membranaires impliquées dans la co-stimulation ou son contrôle (CD4, CTLA-4) • Induction d’une réponse immune adaptative cellulaire à long-terme Modes d’action des AcM à usage thérapeutique

  7. L’infusion d’AcM de souris chez l’Homme => anticorps humains anti-Ac de souris (HAMA) • => neutralisation et clairance accélérée de l’AcM => chute de l’efficacité, • effets secondaires dus à la formation de complexes immuns et • à leur dépôt. • Les AcM de souris ne stimulent pas les fonctions effectrices de l’immunité de façon optimale chez l’Homme : • => faible activation du complément, • => mauvais recrutement des récepteurs pour la région Fc des Ig (RFc) et du RFcn (=> diminution de la T1/2). «L’anticorps murin qui voulait être humain»

  8. Transformation Donneur Immunisé Lignées B (EBV) Lymphocytes B du sang périphérique EBV Criblage Ac1 Ac2 AcM Ac3 Clonage des cellules Ingénierie cellulaire pour générer des AcM humains 1977 : Transformation par l’EBV de lymphocytes B pour produire des AcM (Steinmitz et al., Nature, 269: 420, 1977)

  9. Ingénierie moléculaire pour générer des anticorps humains 1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984) 1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, e Fv) dans E. coli (Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988) 1989 : AcM humanisés (Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989) 1989 : Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989) 1994 : Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)

  10. De la souris à l’Homme… AcM de souris AcM chimérique Domaine Ig de souris Domaine IgG humaine

  11. Ingénierie moléculaire pour générer des anticorps humains 1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984) 1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, e Fv) dans E. coli (Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988) 1989 : AcM humanisés(Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989) 1989 : Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989) 1994 : Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)

  12. De la souris à l’Homme… AcM de souris AcM humanisé DomaineIg murin Domaine Ig humain CDRs murin

  13. Hybridome B de souris ARNt/ARNm Séquençage Comparaison V humains Modélisation 3-D/cristal Détermination CDR/FR contact Greffe CDR Mutations ponctuelles FR AcM, HuIgG1, VL VH huVL huVH Transfection Clonage Génération d’un AcM recombinant humanisé huIgG1,  Lignée cellulaire (CHO, NS1…) Vecteur avec séquences huC1 et huC

  14. Humanisation d’un AcM recombinant Substitutions d’a.a. des FR humains impliqués dans des contacts avec des a.a. des moCDRs greffés: remplacement des a.a. «humains» par les a.a. trouvés à la même position sur les VH/VL murins de l’Ac de souris («FR back mutations»)

  15. Ingénierie moléculaire: anticorps humains 1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984) 1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, eFv) dans E. coli(Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988) 1989 : AcM humanisés (Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989) 1989 : Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989) 1994 : Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)

  16. VH Espaceur VL (GGGGS)3 VHa VLa Etiquette Fv P rbs L Stop Espaceur VLa VHa Etiquette scFv Expression bactérienne de fragments d’anticorps: les « single chain Fv  (scFv) »

  17. Ingénierie moléculaire: anticorps humains 1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984) 1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, e Fv) dans E. coli (Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988) 1989 : AcM humanisés (Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989) 1989: Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989) 1994 : Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)

  18. Banques combinatoires de phages Phage filamenteux pIII scFv

  19. Génération d’AcM humains: sélection de VH/VL humains par criblage de banques de phages filamenteux (« Phage display ») 1. Clonage et expression de régions Fab ou de scFv humains => production d’une banque de phages 2. Sélection de Fab ou de scFv spécifiques exprimés à la surface des phages 3. Isolement des VH/VL spécifiques et «reformatage» sous forme d’IgG entière 4. Transfection et production de l’AcM recombinant dans des cellules eucaryotes (CHO, NS1…)

  20. VL VH Banques combinatoires de phages Lymphocytes B humains ARNt/ARNm ADNc

  21. 1. Adsorption 2. Lavage 3. Elution (pH acide) Génération d’AcM humains: sélection de VH/VL humains par criblage de banques de phages filamenteux (« Phage display »)

  22. Phage sélectionné PCR huVL huVH Génération d’un AcM recombinant humain IgG1, à partir d’un phage sélectionné AcM, HuIgG1, Vecteur avec séquences huC1 et huC Transfection Clonage Lignée cellulaire (CHO, NS1…) ADNc

  23. * ** * * * * Phage display: génération de fragments d’Ac mutés 1. Phage parental 3. Banque de Phages mutants Purification de l’ADN wt scFv ou Fab 2. Mutagenèse

  24. * * * Phage display: sélection de fragments d’Ac de forte affinité Banque de phages mutés Phage muté sélectionné (forte affinité) • Adsorption sur l’Ag • (faible densité) 2. Lavage 3. Elution

  25. Ingénierie moléculaire: anticorps humains 1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984) 1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, e Fv) dans E. coli (Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988) 1989 : AcM humanisés (Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989) 1989 : Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989) 1994: Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)

  26. Génération d’AcM humains: utilisation de souris transgéniques humanisées contenant les gènes d’Ac humains

  27. Invalidation des gènes DJ & J (chaînes H & L) de souris (lignée A) 2. Insertion des gènes codant une partie des chaînes lourdes et légères humaines (YAC) (lignée B). Croisement (AxB) => souris « humanisée » 3. Production d’hybridomes après immunisation 4. Clonage de l’AcM humain et expression dans des cellules eucaryotes (CHO, NSO …)

  28. Immunogénicité des Ac recombinants Ac chimériques: Dépend de l’Ac chimérique: pas, peu ou fortement immunogène(Homologie plus ou moins forte avec les VH/V humains?) 2. Ac humanisés: Peu immunogène mais dépend également de l’Ac considéré Pour tous les Ac recombinants: Rôle de la voie d’injection? Rôle des doses injectées et de leur nombre/fréquence? Rôle de l’antigène ciblé? Test de détection des HAMA utilisé!

  29. - 2 AcM sont des IgG de souris (une IgG1, une IgG2a) - 4 AcM sont des IgG1 humaines chimériques - 9 AcM sont des IgG humanisées (dix IgG1 dont deux Fab, deux IgG4, une IgG2/4) - 9 AcM sont des IgG humaines (sept IgG1, deux IgG2) - 1 Ac bi-spécifique (rat IgG2b/souris IgG2a) - 2 Fab (un chimérique PEGylé, un humanisé) Les 27 AcM utilisés en clinique en 2012 (FDA+EMEA) * Juin 2012

  30. 33 AcM sont/ont été sur le marché* et ont généré des revenus de près de quarante milliards d’Euros en 2011: - 8 AcM dans les maladies inflammatoires/auto-immunes - 1 AcM dans les maladies infectieuses (VRS) - 3 AcM dans la transplantation - 1 AcM dans les maladies cardio-vasculaires - 1 AcM dans une maladie neuro-dégénérative (SEP) - 1 AcM dans l’asthme allergique - 15 AcM en oncologie - 1 Acm en ophtalmologie (DMLA) - 1 AcM dans les maladies osseuses -1 AcM en hématologie (HPN) Les AcM utilisés en clinique (FDA+EMEA+ Chine) * Juin 2012

  31. NomType Ex. d’anticorps xxmOmabMouse muromonab (souris) britumomab xxXImabChimeric rituximab (chimérique) cetuximab XXZUmabHumanized trastuzumab (humanisé) alemtuzumab XxmUmab Fully Human panitumumab (humain) adalimumab Quelques règles de lecture à propos des AcM

  32. Optimiser les anticorps monoclonaux *Optimisation de la fixation des AcM et des effets biologiques induits sur la cible : - affinité et avidité - spécificité «fine»: choix de l’épitope (effets pro-apoptotiques, cytostatiques …) *Optimisation des fonctions effectrices : - meilleurs recrutement et activation des cellules effectrices [cellules NK, neutrophiles, monocytes/ macrophages, CTLs (anticorps bispécifiques, «T-bodies»)] - meilleure activation du complément (C1q) (voie classique: IgG3> IgG1, IgG2) => formation du Complexe d’Attaque Membranaire

  33. Lyse BsAb Ag cible Cellule cible (A) Lyse AcM optimisés: les anticorps bispécifiques (BsAb) BsAb Phagocytose Ag cible Cellule cible Molécule de stimulation Cellule effectrice (B) Drogues Cytokines Vecteurs Haptènes bivalents

  34. Fusion Sélection (Milstein & Cuello, Nature, 305, 537-540, 1983) Anticorps bispécifique: 1. Ingénierie cellulaire (quadromes) BsAb

  35. Anticorps bispécifique: 2. Ingénierie biochimique (MDX-260, anti-CD64/anti-GD2) Q représente le N-éthyl succinimidyl; R, le O-phénylène-dissuccinimidyl

  36. VH Espaceur (GGGGS)3 VL VHa VLa Etiquette Fv P rbs L Stop Espaceur Espaceur Espaceur VLa VLb VLa VLa VLa VHa VHa VHb VHa VHa Tag Etiquette Etiquette Etiquette scFv “Diabody” bivalent “Diabody” bispécifique Anticorps bispécifiques: 3. Ingénierie moléculaire

  37. Génération et ingénierie de fragments d’Ac 1989: Isolement de domaines VH ayant de fortes affinités à partir de banques de domaines VH exprimés dans E. coli(Ward et al, Nature, 341:544) 1993: Ac intracellulaires (“Intrabodies”) (Marasco et al, PNAS, 90:7889) et fragments Fc à usage thérapeutique (Debré et al, Lancet, 342:945) 1993: Ingénierie moléculaire de formats bispécifiques: “diabodies” (Holliger et al, PNAS, 90:6444), “triabodies”…. 1993: Découverte d’Ac de Camelidædépourvus de chaînes légères (Hamers-Casterman et al, Nature, 363:446) 2008: Régression tumorale chez des patients cancéreux après injection de très faibles doses de fragments d’Ac bispécifiques (Bargou et al, Science, 321:974)

  38. Expression (« Hooking ») Espaceur TM ± région IC (GGGGS)3 Expression + transduction (« T-bodies ») Expression de «single chain Fv  (scFv)» à la surface de cellules de mammifères VHa VLa Tag P/O L Stop Espaceur VLa VHa TM ± IC Tag scFv-TM-IC

  39. Anticorps bispécifique de lama VHH: ciblage du RFcIII/CD16 et d’un antigène associé aux tumeurs (ACE) VHH (anti-ACE) - huC VHH (anti-RFcIII) - huCH1 Fab-like (bispécifique) Cellule NK RFcIII ACE Cellule tumorale VHH Ab bispécifique

  40. Utilisation de fragments scFv comme «intrabodies» L’expression intracellulaire d’un scFv anti-ras neutralisant à l’aide d’un vecteur viral induit la régression tumorale dans des souris nude (HCT 116) Espaceur VLa VHa Tag scFv

  41. Anticorps monoclonaux optimisés: ingénierie de la région Fc (IgG1)

  42. Fonctions effectrices des IgG dépendantes des récepteurs pour la région Fc des IgG (RFc) * Fixation aux RFc activateurs (I, IIA, III): * La cytotoxicité dépendante d’anticorps (ADCC)(cellules NK, monocytes, neutrophiles) * La phagocytose de particules opsonisée (DC, (macrophages) * L’endocytose de complexes immuns (monocytes, DC, macrophages, neutrophiles, lymphocytes B) * La sécrétion de cytokines et chimiokines * Fixation aux RFc inhibiteurs (IIB) : blocage de l’activation cellulaire induite par d’autres récepteurs (BCR, RFc, RFc activateurs…) (lymphocytes B, mastocytes, monocytes…)

  43. Anticorps monoclonaux optimisés: ingénierie de la région Fc (IgG1) Stratégies d’ingénierie de la région Fc : 1. Criblage et sélection d’anticorps IgG1 ayant une région Fc mutée 2. Modification de la glycosylation de la région Fc des anticorps IgG1

  44. WT Sélection de mutants IgG1 ayant une fixation accrue au RFcIIIA et présentant une plus forte ADCC Stratégie: mutagenèse dirigée de tous les acides aminés exposés aux solvants dans les domaines CH2 et CH3 d’une IgG1 humaine (anti-HER2/Neu, trastuzumab) Mutants >WT ( FcRIIIA binding)* T256A K290A S298A E333A K334A A339T S298A/E333A S298A/K334A S298A/E333A/K334A * Numérotation «Eu»(Shields et al., J. Biol. Chem., 2001) AICC

  45. Anticorps monoclonaux optimisés: ingénierie de la région Fc (IgG1) Stratégies d’ingénierie de la région Fc : 1. Criblage et sélection d’anticorps IgG1 ayant une région Fc mutée 2. Modification de la glycosylation de la région Fc des anticorps IgG1

  46. Cpm G0 G1 G1F G2F m/z (courtesy of L. Krummen, Genentech, Inc., USA) Glc NAc Mannose Galactose Fucose 1,6 NeuAc 2,6 Hétérogénéité de la glycosylation des AcM

  47. Ingénierie de la glycosylation (IgG1 humaines) L’absence de fucose ou un contenu faible en fucose (20-35%), La présence de galactose et/ou de galactose et d’acide sialique à l’extrémité de/des GlcNAc terminales, La présence d’une GlcNAc intercalaire, accroissent la fixation aux RFc et augmente l’ADCC des IgG1 monoclonales humaines

  48. Les anticorps monoclonaux optimisés * Optimisation des propriétés pharmaco-cinétiques * Meilleure bio-distribution et ciblage (notamment au site de la tumeur) * Meilleure capture de drogues, vecteurs viraux, et haptènes radio-marqués au voisinage de la cellule-cible (dans la plupart des cas, des cellules tumorales)

  49. Un, deux, trois AcM (bio-terrorisme, oncologie…)? • - Les anticorps conjugués aux drogues (immunoconjugués): le grand retour de la “magic bullet”? • Les nouveaux formats (Ac bi- ou tri-spécifiques, simples domaines VH, VHH…? • Nouvelles utilisations: anticorps intra-cellulaires, fragment d’Ac à la surface de cellules effectrices (« T-bodies ») ou cibles (« Hooking »): AcM et thérapie cellulaire? • Qu’est ce qu’un biosimilaire?! Les nouveaux défis des anticorps monoclonaux

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