第九章 动物组织培养

1. 第九章 动物组织培养

2. 第一节、动物组织培养的基础一、动物细胞 特点；无细胞壁倍增时间长，生长缓慢需氧量少，对搅拌敏感聚集体形成原代细胞培养50代即开始退化

4. 二、 动物细胞培养定义动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。是动物细胞工程的基础。

5. Classification of Cell CulturesPrimary CultureCells taken directly from a tissue to a dishSecondary CultureCells taken from a primary culture and passed or divided in vitro.These cells have a limited number of divisions or passages. After the limit, they will undergoapoptosis.Apoptosis is programmed cell death

6. Primary Culture outgrowth and migration of cells retention of the 3D shape

7. 细胞系：原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力，类型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。细胞株：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。原代培养后得到细胞系，再经多次传代培养后，一部分细胞死亡，一部分细胞继续生长并转化为连续细胞系或无限细胞系。细胞系：原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力，类型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。细胞株：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。原代培养后得到细胞系，再经多次传代培养后，一部分细胞死亡，一部分细胞继续生长并转化为连续细胞系或无限细胞系。

10. 3、生长特性根据形态特征分类贴壁型（粘附型细胞）上皮细胞型、 成纤维细胞型、 游走细胞型、 多形细胞形。

11. 粘附生长本是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式。粘附有两种含义：一是细胞之间相互接触；二是细胞与细胞外基质结合。 动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞是必须附壁即附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生长，这时若取走一片细胞，存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重新布满创面。

12. 两种贴壁的培养细胞

13. Contact nhibitionWhen cells contact each other, they cease their growth.Cells arrest in G0 phase of the cell cycleTransformed cells will continue to proliferate and pile upon each other

14. 悬浮型体外生长不必贴壁，可在培养液中悬浮生长，因此也叫悬浮型细胞。一些在体内原本就以悬浮状态生长的细胞或微生物，当接种于体外环境中也可以以悬浮状态生长。血液白细胞、淋巴组织细胞，某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等都属此类细胞。这类细胞形态学特点是胞体始终为球形。悬浮型体外生长不必贴壁，可在培养液中悬浮生长，因此也叫悬浮型细胞。一些在体内原本就以悬浮状态生长的细胞或微生物，当接种于体外环境中也可以以悬浮状态生长。血液白细胞、淋巴组织细胞，某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等都属此类细胞。这类细胞形态学特点是胞体始终为球形。

15. 第二节、常用的细胞培养方法一、培养细胞的生存环境1.环境无毒和无菌；2.适宜的温度；人和哺乳动物培养细胞最适温度均为35－37℃。3.气体环境和氢离子浓度；需要一定量的O2（1995－9975pa）和CO2（95％空气+5%CO2）；pH7.2-7.44.渗透压；260－320mOsm/kg适用于大多数细胞5.营养物质；六碳糖是主要的能源物质，还需要12种基本氨基酸和谷胺酰胺等

16. 二、动物细胞培养的特殊性1、大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体的表面才能生长。 2、动物细胞对于营养要求更加苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需要血清。

17. 3、对于培养环境的适应性更差，对环境极其敏感，包括 pH 、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需严格监控。 4、动物细胞生长缓慢，因此培养时间较长。 对环境的影响又比微生物为大，因此常用空气、氧、二氧化碳和氮的混合气体进行供氧和调节pH。

18. 三、Medium • liquid in which cell are grown • contains • physiologic (pH, osmolarity) • supraphysiologic (hormones, nutrients) • nonphysiologic (dyes, antibiotics)

19. Medium

20. Medium

21. Medium • Dissolved gases • to control pH together with NaHCO3 H2O + CO2 H2CO3 H+ + HCO3- • Handerson-Hasselbach eqn predicts pH: • pH = 6.0966+log([HCO3-]/[CO2 ]) addition of NaHCO3 increases HCO3- thus promotes H2C03 formation increasing pH 5-10% ambient CO2dissolves in the medium  decreasing pH

22. Medium • Dissolved gases • What if 5%  10%? • pH drops to 7.2 from 7.4 • Oxygen consumption by cells: • delivery is different than in vivo • diffusion as opposed to hemoglobin transport • limited by • solubility of oxygen in media at 37 C • transport from gas phase to cell surface • dissolution, diffusion and consumption

23. Pg, Oxygen tension provided by the incubator • Pc, Oxygen tension at the bottom of the dish • Diffusion based on Fick’s law • D*K*(Pg-Pc)/d • where D: diffusivity of O2 in water at 37C • uptake rate = diffusion rate

24. Medium • Oxygen: pH of the medium at high cell #? • O2 consumption per unit area increases • O2 concentration on the cell surface decreases • shift to anaerobic metabolism • formation of lactic acid and CO2! • be alarmed if phenol red turns to orange!

25. Medium • Pc and media height and Pg…. • Pc depends on Pg and d •  Pg Pc • note much lower Pc at the corresponding Pg… • due to low solubility of O2 and diffusion barrier • Cells spread with  Pg, why? •  d,  diffusion resistance, Pc

26. Medium • Serum • liquid that remains after plasma is allowed to clot • added to medium by 1-20% v/v • calf, fetal bovine, horse, human • batch to batch variation!! • contents interfere with what cells produce (use radiolabeling)

27. Solutions used in cell culture①Phosphate Buffered Saline - Ca2+ Mg2+ Free (PBS-CMF)Used to wash/remove excess serum that inhibits the function of TRED. Calcium will also inhibit the function of TRED.Must be warmed in the water bath before use so cells are not shocked by cold liquid.

28. Trypsin EDTA (TRED)An enzyme used to detach the cells from a culture dish.Trypsin cleaves peptide bonds (LYS or ARG) in fibronectin of the extracellular matrix.More about fibronectin and the ECM next weekEDTA chelates calcium ions in the media that would normally inhibit trypsin.

29. Trypsin will self digest and become ineffective if left in water bath more than 20 minutes.Trypsinizing cells too long will reduce cell viability

30. Trypan BlueAn exclusion dyeLiving cells cannot take up the dye and will appear bright and refractile.Dead cells with broken membranes will absorb the dye and appear blue.Usually add 200 ml of trypan blue to 200 ml of cell suspension in eppendorf tube

31. 四、常用的培养方法（1）、悬滴培养法是最早建立的体外培养技术，是组织、器官培养的经典方法，最早是由Harrison于1907年创立的。基本要点是：将组织或器官植块接种在一张盖玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使植块及营养液悬挂在盖玻片下，再置放于一凹形载片之上，最后用熔蜡密封后放入培养箱中培养。

33. 单玻片的再培养 • 1）用消毒剃须刀刮去盖玻片四周的石蜡 • 2）用镊子小心揭开盖玻片，培养物面朝上，放入培养皿内。 • 3）用白内障刀切除生长晕周围部分，留下方形培养物，并切成小块。 • 4）将小块在含有平衡盐溶液的培养皿中再漂洗，移入另一含有平衡盐溶液的培养皿内，进行再培养。

34. （2）培养瓶培养法将拟培养对象直接接种于培养瓶内，再放入培养箱进行培养。凡是可以用于培养生物结构的瓶子都可称为培养瓶。（2）培养瓶培养法将拟培养对象直接接种于培养瓶内，再放入培养箱进行培养。凡是可以用于培养生物结构的瓶子都可称为培养瓶。

36. （3）旋转管培养法将培养物接种于一管状培养器皿中，再将其固定在一可以旋转的装置上，旋转培养的一种方法。（3）旋转管培养法将培养物接种于一管状培养器皿中，再将其固定在一可以旋转的装置上，旋转培养的一种方法。

37. （4）灌注小室培养法将细胞接种于一个由上下两个盖玻片（分别构成上壁与下壁）与一金属圈（构成侧壁）密封围成的小室内，保持在一定条件下培养。在小室的侧面分别有液体流入和流出的开口，供新鲜培养液流入小室和旧培养液排出。 最初是1912年由Burrows尝试设计了一种简单的灌注小室培养模型。

38. （5）培养板培养法具体做法是将培养细胞接种在培养板的孔内，然后在CO2培养箱内培养。最常用的培养板有6孔、24孔和96孔培养板，后者最为常用。一般都是一次性使用。

39. 第三节、培养细胞的生长与保存 一、培养细胞的生长阶段 （一）原代（初代）培养期 • 指从体内取出组织接种培养到第一次传代培养这个阶段，一般持续1-4周。在这个阶段，细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。

40. （二）传代期 • 原代培养细胞一经传代后便该称为细胞株，在全生命期中该阶段的持续时间最长。一般情况下，当传代10-50次后，细胞增殖逐渐缓慢，以致完全停止。

41. （三）衰退期 • 该阶段细胞仍然生存，但是增殖很慢或不增殖。细胞形态轮廓增强，最后开始衰退凋亡。

43. Cells reach confluence (cover all available surface) Kinetics of Growth Logarithmic scale!!!

44. 二、原代培养与传代培养技术 • 原代培养 的过程图解

45. 机械分散组织细胞方法

46. 消化初代培养法基本步骤

47. 组织块初代培养法

48. 一般传代培养的步骤 • (1)吸出培养瓶内旧培养液。 • (2)加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底。 • (3)2～5分钟后检查，如有细胞间隙变大，细胞质回缩现象，终止消化。 • (4)吸出消化液，加入Hanks液，轻轻转动以免细胞流失，洗去残留的消化液。如果单用胰蛋白酶，可直接加入培养液。 • (5)用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液，计数后记录其浓度。 （6）重新接种培养。

49. 消化法传代培养步骤

50. 三、Cryopreservation • How does freezing induce damage? • cool too fast  formation of ice crystals inside the cell • cool too slow  hypertonic extracellular solution  dehydration • transport of water across membrane  thermo dynamics of ice formation  kinetics of ice growth • Thawing rate is also important (thaw rapidly)