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Genética Molecular em Análises Clinicas

Genética Molecular em Análises Clinicas. TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS. Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos. PCR Real Time PCR NASBA/TMA. PCR. OPTIMIZAÇÃO DO PCR. [MgCl 2 ] Th [dNTP] [primers] [DNA] [inibidores]. Variações. RT-PCR Multiplex PCR Nested PCR.

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Genética Molecular em Análises Clinicas

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Presentation Transcript

  1. Genética Molecular em Análises Clinicas TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS Prof.Doutor José Cabeda

  2. Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos • PCR • Real Time PCR • NASBA/TMA

  3. PCR

  4. OPTIMIZAÇÃO DO PCR • [MgCl2] • Th • [dNTP] • [primers] • [DNA] • [inibidores]

  5. Variações • RT-PCR • Multiplex PCR • Nested PCR

  6. Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos • PCR • Real Time PCR • NASBA/TMA

  7. Principio de funcionamento do Real-Time PCR Prof.Doutor José Cabeda

  8. Detecção dos produtos de PCR

  9. Montar uma reacção

  10. Químicas Utilizáveis Prof.Doutor José Cabeda

  11. Detcção com SybGreen

  12. Sybr-Green Detection • Intercalates to dsDNA • Inhibits DNA amplification so concentration is critical • Detects specific and non-specific targets • Low starting background with large increase in signal • Can run a melt curve to look at product specificity

  13. Detecção com sondas

  14. Quimicas utilizáveis:sondas taqman

  15. Quimicas utilizáveis:molecular beacons

  16. Quimicas utilizáveis:sondas FRET

  17. Transfer Excitation Emission Hyb-ProbesTM Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: Quencher Prof.Doutor José Cabeda

  18. MGB MGB F F F F F Q Q Q Q Quimicas utilizáveis:mgb-probes

  19. Aplicações Quantificação Prof.Doutor José Cabeda

  20. End Point versus Real-Time

  21. Quantificação

  22. Aplicações Detecção de Mutações / SNP Prof.Doutor José Cabeda

  23. Detecção de mutações

  24. Aplicações Multiplex Detection Prof.Doutor José Cabeda

  25. Detecção simultânea de vários produtos

  26. Os equipamentos Prof.Doutor José Cabeda

  27. Light Cycler

  28. Smartcycler

  29. Rotorgene • The samples spin continually during a run at 500 rpm • The samples are heated and cooled in a low mass air oven • Tubes are illuminated as they pass the detector • On data acquisition energy is averaged over 20 revolutions to give the fluorescence of each sample • Four Channels • Ch1: ex 470nm, det 510nm • Ch2: ex 530nm, det 550nm • Ch3: ex 585nm, det 610nm • Ch4: ex 625nm, det 660nm

  30. Near-patient-testing

  31. Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos • PCR • Real Time PCR • NASBA/TMA

  32. NASBA/NUCLISENS

  33. Amplification: schematic diagram Primer 1 Legend: Reverse Transcriptase • sense RNA • antisense RNA • sense DNA • antisense DNA RNase H Primer 2 Reverse Transcriptase T7 RNA polymerase Primer 2 Reverse Transcriptase Reverse Transcriptase RNase H Primer 1

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