第三章癌症的分子診斷

第三章癌症的分子診斷 • 幾乎癌組織都是單株性增殖( clonal proliferation) • 患者的所有癌細胞都起源於單一的癌細胞 • 大多數癌症不能用單基因遺傳方式解釋 • 某些類型的癌症，親屬發生同類腫瘤的風險會增加，但不表現孟德爾式遺傳 • 許多癌症與環境的物理化學因子或生物因子有關

細胞週期的調控 • 受細胞週期素(cycIin)及相對應的細胞週期素依賴激酶 (cyclin-dependent kinase， CDK)嚴格調控 • 細胞週期的每階段都有一組 CDKs與cyclins 交互作用來調控 • CDK的磷酸化及cyclin-CDK抑制劑(CKIs)的活化都會影響細胞週期

癌症相關基因

致癌基因(oncogene) • 1911年Rous發現的雞的腫瘤傳染因子是一種病毒，為反轉錄病毒 • 癌化作用是因為病毒基因組內特殊致癌基因(v-onc) • 哺乳類的基因組上，也存在有同源的序列 (e-onc) • 調控胚胎的發展、細胞的增殖、分化和凋亡 • 調控失常，會使細胞發展為惡性表型，正常細胞中具有這樣潛能的基因稱為原(致)癌基因( proto-oncogene)

原(致)癌基因 • 調控生長分化、信號傳遞、轉錄因子、細胞週期 • 生長因子 • 病毒來源的sis基因與細胞來源的原癌基因-血小板衍生性生長因子次單位 • 細胞表面生長因子受體 • 表皮生長因子受體基因( epidermal growth factor receptor， EGFR) • 集落刺激因子1受體(CSF1R)基因相當， CSF1R是一種促進骨髓中多種細胞分裂的生長因子

細胞內信號傳遞系統( Intracellular signal transduction systems) • RAS家族是信號傳遞通路G-protein的成份，藉由跨膜蛋白與Gprotein的結合將信號傳至核內 • 蛋白質-酪胺酸激酶( protein tyrosine kinase) ABL是細胞內信號傳遞蛋白與信號傳遞至核內有關 • 核內轉錄因子 • MYC是DNA結合蛋白，而JUN是轉錄因子 • 細胞週期有關的蛋白 • 調控細胞週期相關的激酶和激酶抑制物，

病毒性癌基因 • 只有少數人類反轉錄病毒引起人類癌症 • HIV 可以促進細胞增殖和增加體細胞突變的機會，或插入基因組促使鄰近基因活化引起免疫缺陷而間接促進腫瘤的產生 • 病毒癌基因插入宿主癌化的原因 • 有些的癌基因產物作用如同細胞癌基因產物 • 有時插入的病毒癌基因是斷裂的，這些斷裂的序列可能是基因內的調控序列 • 有些病毒癌基因的產物與細胞癌基因產物共存，可能調節癌蛋白活化

腫瘤抑制基因( tumor suppressor gene) • 在遺傳學上，癌基因對細胞的作用是顯性作用( dominant effect) • 可抑制oncogene作用的基因，稱tumor suppressor gene • 抑癌基因的蛋白產物能抑制細胞不正常生長及抑制細胞癌化 • 遺傳學上一般屬於隱性的 ( recessive) • RB基因 • 視網膜母細胞瘤( retinoblastoma， RB) ，一種侵犯幼兒視網膜的腫瘤 • 散發性非遺傳的類型最常見，會造成單側眼睛病變 • 約1/3的RB病人產生多發性腫瘤，且常造成雙眼的病變，及在同胞兄弟姊妹中可發生同樣病變，家族傾向遺傳性

RB基因的功能 • 蛋白質產物pRb是細胞週期的煞車器 • pRb 蛋白發生週期性的磷酸化反應 • pRb蛋白在GI期是細胞週期抑制信號的集合點，這個以pRb蛋白為中心的抑制傳導途徑，稱為RB傳導途徑 • 靜止的細胞( G0IGI) ， pRb沒有磷酸化 • Gl期之末，在有絲分裂時它是磷酸化的 • 非磷酸化的pRb在進入S期之前可與幾種蛋白質結合調控細胞週期

p53基因 • 抑制腫瘤生長的作用，基因定位在17p ， p53是其分子量(53 kD) • 在人類的大腸癌中有70%因失去 p53功能 • 50%的肺癌、40%的乳癌也因p53去活化而誘發 • 人類癌症約有一半起因於p53突變缺陷或失去作用 • 發生突變的蛋白質可能原因 • 兩個alleles都發生缺失 • 一個allele上發生錯義點突變，會抑制另一個正常野生型基因的功能

正常細胞中， p53的量都很低 • DNA損傷時， p53就大量增加，造成 • 生長的停止或細胞凋亡( apoptosis) • p53就激活p21蛋白質關閉細胞週期 • p21蛋白質是一個CDK 的抑制因子 • 可結合CDK2、CDK4、CDK6，並抑制它們的活性 • 細胞進入S期以前，得以修護受損傷的DNA • 若細胞已將進入S期，已不能修護受損傷的DNA，則p53起動細胞凋亡 • 這二種功能保持基因組的穩定性，p53稱為基因組保護者( guardian of genome)

細胞凋亡(apoptosis， programmed cell death)基因與癌症 • 細胞凋亡是一種有計畫的控制細胞死亡的方式， Apoptosis此字源自於希臘文，意思是指樹葉從樹上凋落之意 • 正常生理情況下細胞凋亡是生命過程所必須的，平衡著細胞的數量 • 生物發育的階段 • 高等動物在胚胎發育過程中的特定階段，特定區域的多餘細胞都會發生凋亡，以利於組織器官形態的形成

病理情況下的凋亡 • 人為的方式改變荷爾蒙分泌後，內分泌依賴組織的萎縮 • 組織損傷後血液造成大量自由基所產生的細胞凋亡 • 細胞DNA受到物理化學的因子傷害，也會促使細胞凋亡 • 在一些病毒感染的情況下，在病毒還未完全被複製時也會使細胞凋亡，以抑制病毒持續感染

細胞凋亡機制在生物中具有高度保留性 • 線蟲已發現至少15個基因與凋亡有關 • ced-3和ced-4促進凋亡 • ced-9則通過阻止ced-3和ced-4的活化而保護細胞免於凋亡 • 哺乳動物同源物 • ced-3 vs 半胱胺酸蛋白水解酶( cysteine proteases) caspases • ced-9 vs Bcl-2蛋白家族 • ced-4 vs Apaf-l (HeLa細胞)

caspase蛋白水解酶，能專一性的在天門冬胺酸位 置裂解蛋白質 • caspase在正常細胞中以未活化的酶原存在 • 細胞接受凋亡訊號後， caspase 自身催化或者被其它caspase裂解而活化 • 活化的caspases再繼續裂解許多細胞內基質 • 維持細胞骨架的蛋白actin、Gas2、Lamins • 負責DNA修復的PARP、DNA-PK • 訊息傳遞蛋白PKC-δ、PITSLRE kinase • 至今約有14種哺乳類動物的caspases被鑑定出來

依據caspases與細胞凋 亡在細胞死亡時所扮演之角色，可分為 • Initiator (upstream) caspases • Effector (downstream) caspases • 當受到凋亡刺激時，首先initiator caspases (主要為8、9、10 )被活化 • 進行effector caspases的活化 • 主要為caspases-3、6與7，其負責細胞凋亡時受質蛋白的水解 • 藉由cytochrome c 、Apaf-l及caspase-9形成的apoptosome複合體 • 活化caspase-9驅動caspase放大效應

細胞凋亡的異常使不正常細胞累積，造成了癌症、發炎症 及自體免疫性疾病 • 過度的細胞凋亡在神經退化性疾病、AIDS 、骨質疏鬆症、心臟病 • 原癌基因( proto- oncogene)和腫瘤抑制基因都參與了apoptosis的調控 • MYC原癌基因對細胞增殖及凋亡有雙向調控 • MYC與MAX形成複合物會啟動細胞的增殖或凋亡過程，主要是決定於細胞的微環境 • 一些腫瘤抑制基因，如:p53、APC及PTEN藉由誘導凋亡來抑制腫瘤細胞的產生，如果這些抑制功能喪失就可能造成腫瘤的生長

癌症有關的現象 • 染色體不穩定性 • 癌化的細胞中常見到三倍體和單倍體 • 染色體的缺失，還有染色體大片段的重排(插入、重複、缺失、倒轉、易位) • 染色體之間或染色體本身的交互作用，可能也參與了細胞基因表達的調控 • 利用FISH相關技術偵測染色體不穩定性 • 多色螢光FISH (multifluor-FISH) • DNA結構不穩定 • 微衛星不穩定 • 異質性丟失

腫瘤的發展過程是多基因多突變多因素累加的效果，突變中獲得腫瘤的發展過程是多基因多突變多因素累加的效果，突變中獲得 • 不必依賴外在的生長訊號 • 對外在的抗生長訊號不反應 • 不會凋亡 • 有能力無限複製 • 有能力產生支持性的血管(血管新生， angiogenesis) • 具有侵入組織及轉移的能力

微衛星不穩定MSI • 正常組織STR相比較，出現STR重複次數的增加或減少，得到不一樣的pattern • Microsatellite DNA markers廣泛使用在偵測腫瘤初期基因組不穩定現象 • Mao et al. (1996) ，使用microsatellite analysis偵測膀胱癌的尿沉澱物，有95%的檢出率 • DNA片斷異質性丟失( loss of heterozygosity、LOH) • 來自父系或母系的同-區域的DNA，有多形性的變化(如 SNP、STR、VNTR) ，但並不改變該區域基因的功能，稱異質性的變化 • 癌化過程喪失此多形性的變化稱之，此位置常是抑癌基因的所在

DNA甲基化與癌症 • 人體大約有一半的基因含有CpG islands • 尤其是持家基因和組織特異性表現的基因 • 與正常細胞比較， DNA的甲基化在癌細胞上顯示出甲基化型式的異常 • 腫瘤抑制基因與癌相關基因CpG島高度甲基化，癌基因及重複序列低度甲基化

癌症的診斷 • 雷射捕獲微切割技術(Laser capture microdissection，LCM) • 在腫瘤組織中通常還混有正常的大量的非腫瘤組織(基質細胞、血管組織、免疫反應細胞) • 這些正常的基因可能模糊了腫瘤異常基因的表現 • 對於癌前組織或早期及無惡性變化的腫瘤相關組織基因改變情形所知有限 • LCM技術對於癌前組織的變化及腫瘤發生、發展、演變的過程中提供了樣本的來源

1996年由美國NIH Liotta實驗室所發展 • 將切片表面貼一層ethylene-vinyl acetate (EVA)膜 • 切片放在倒置顯微鏡載物台 • 打開雷射光對準目標區，溶掉局部膜，固化 • 可分離到單一類型的細胞群 • 偵測LOH (Loss of heterozygosity ) • 染色體基因不正常代表著整個片段基因的缺失或獲得 • 這片段可能在腫瘤發生有關的基因區域 • p53、APC基因位置的LOH • 利用毛細管電泳CE偵測

偵測MSI (microstatellite instability ) • 也可以說是複製差錯( replication error) ，導致寡核苷酸重複序列長度的改變 • 使腫瘤細胞基因組不穩定而降低整體細胞忠實複製 DNA的能力 • MSI與DNA錯配修復基因息息相關 • DNA修補基因雙套突變， LOH或promoter的甲基化，會使基因失去活性而沒有修復功能)

蛋白質截短檢測(protein truncation test， PTT ) • 檢測蛋白質層次上的突變 • 造成蛋白質轉譯後縮短蛋白的原因 • 單個鹼基的插入 • 缺失產生一個stop codon的無意義突變 • 或移框突變( frameshift mutation) • 剪接位點的插入缺失造成剪接位點的改變 • 應用在沒有突變熱點且錯義突變(單鹼基突變造成胺基酸改變)發生很低的基因上

淋巴瘤的診斷 • 每一個淋巴細胞在發育過程中都會經歷免疫球蛋白基因Ig或T細胞受體基因的重排 • 造成成熟的淋巴細胞各帶有不同的免使球蛋白 • 抗體基因重排多樣化之機制由利根川進解開( 1987年諾貝爾醫學獎) • V基因的特異5‘端引子及一個J基因片段的特異性 3 ’端引子 • 在非腫瘤中每一個淋巴細胞都在V-D和D-J插入了任意數目的鹼基，所以PCR產物在電泳膠上電泳帶是一片模糊(smeared) • B細胞淋巴瘤來自同一株化的淋巴細胞，有相同的VDJ基因重排，所以有獨立分開的電泳帶

基因晶片在癌症的應用 • 人類p53基因位於第17號染色體短臂13區1帶(17p13.1)上 • 全長為 20 kb 由11個exon和10個intron組成，編碼393胺基酸 • 90%以上的點突變位點發生在相對保留的第5~8 exon上 • 突變熱點集中在密碼子273、 175、248、245、249、282等位點上 • 因p53突變位點複雜， Affymetrix公司將p53基因exon 5~8可能的突變位點全部點在晶片上，構建一個p53 GeneChip

將腫瘤基因的擴增產物利用標誌 (綠色)與晶片雜交 • 從雜交圖看雜交探針所出現螢光信號，最亮點表示所測出的鹼基 • 參照正常野生型這個位點的鹼基，就可知有沒有點的突變

微小殘癌的檢測( minimal residual disease， MRD) • 當惡性腫瘤經過治療後，有時會有殘留的癌細胞 • 做細胞 FISH的分析，或者使用流式細胞術來分析 • 利用外周血液及定量PCR的方法來檢測有明確特異性位點的基因突變或染色體重排 • 偵測血中轉移的腺癌，鱗狀上皮癌等非血液的腫瘤 • 利用癌細胞獨有而血液細胞無的基因做為標的，再利用real-time RTPCR或nested RT-PCR等技術來偵測血中是否含有這些癌細胞

起動子甲基化的檢測 • 致癌基因起動子的低甲基化 • 抑癌基因起動子的過度甲基化 • 利用甲基化 PCR，甲基化定序等方法來檢測起動子的甲基化 • 癌症的形成，也會造成基因剪接的異常， non-coding RNA (如micro RNA) 的變化 • 利用RT-PCR、real-time qRFPCR， micro RNA array， exon array等來探討這些變化

第三章 癌症的分子診斷