Neurofibromatóza typu 1 (NF1)

1. RNA diagnostika neurofibromatózy typu 1Kratochvílová A., Kadlecová J., Ravčuková B.,Valášková I. a Gaillyová R.laboratoř molekulární diagnostiky, OLG, FN Brno, Černopolní 9

2. Neurofibromatóza typu 1 (NF1) Neurofibromatóza typu 1 patří do skupiny neurokožních syndromů primárně postihujících tkáně odvozené od nervových kmenových buněk. Je to autozomálně dominantní choroba s četností 1:3500, je způsobena mutacemi v genu NF1, kódujícím protein neurofibromin. Klinické projevy: 1. Lish noduly v oční duhovce 2. skvrny „bílé kávy“ na kůži 3. kožní a podkožní neurofibromy 4. abnormality skeletu 5. malignity centrálního a periferního nervového systému 6. vzácně mentální retardace atd.

3. Diagnostická kritéria neurofibromatózy typu 1

4. Struktura NF1 genu - lokalizován na chromozomu 17q11.2 - 350 kb - 60 exonů - 11 - 13 kb mRNA - alternativní sestřih: exon 9br 23a 48a

5. Neurofibromin Translačním produktem genu NF1 je protein neurofibromin, skládající se z 2818 aminokyselin s odhadovanou molekulární hmotností 327 kDa. Jedinou oblastí na molekule neurofibrominu s jasně popsanou biologickou funkcí je centrální doména o 360 aminokyselinách (exony 21 - 27), (s vysokým stupněm homologie k Ras - specifickým GTPázy aktivujícím proteinům) - “GAP-related domain” (NF1-GRD). Touto doménou neurofibromin urychluje konverzi Ras z aktivní (GTP-vázané) do inaktivní (GDP-vázané) formy. Inaktivace Ras vede k regulaci buněčného růstu, při ztrátě této funkce neurofibrominu v tumorech (na obou alelách) dochází ke zvýšenému buněčnému růstu, neurofibromin ve své funkční podobě tedy působí jako tumor supresor.

6. Exprese neurofibrominu v lidských tkáních NF1 expression in normal human tissues based on proprietary W.I.S DNA array results

7. Mutace v genu NF1 - jedna z nejvyšších mutačních rychlostí u lidské choroby (1x10-4/gametu/generaci) - 50% případů de novo - široké spektrum mutací: od bodových mutací až po komplexní přestavby - žádné významnější “hot spot” oblasti (ex. 10 a ex. 37?), mutace rozloženy po celém genu.

8. Komplikace při molekulární diagnostice NF1- nesnadné stanovení klinické diagnózy NF1- až 50 % případů de novo- vysoká mutační rychlost genu NF1- velikost genu (350 kb, 60 exonů) - absence hot spot oblastí - nutnost vyhledávání mutací v celém genu - nejasná korelace mezi typem mutace a formou postižení - neurofibromin - známa funkce pouze jeho centrální domény - různé klinické projevy i u pacientů nesoucích stejnou mutaci

9. Vazebná DNA analýza Mutační analýza Přímé sekvenování intragenový DNA polymorfismus DNA/RNA vyhledávací metody IVS27AAAT2.1, IVS27AC28.4 DGGE, SSCP IVS38GT53.0 - i 38 cDNA / SSCP Prenatální diagnostika Strategie molekulárně - genetického testování NF1 pacientů DNA / RNA pacienta

10. RNA diagnostika genu NF1 - dříve používána pouze DNA diagnostika: u pacientů skrínováno 8 exonů ze 60 - pomocí RNA diagnostiky prohledávána celá kódující oblast genu (využití přepisu RNA do bezintronové cDNA ): rozdělení cDNA do deseti úseků o délce okolo 1000bp. - možnost zachycení mutací ovlivňujících sestřih (u NF1 časté)

11. RNA diagnostika genu NF1 celková RNA - založena na detekci mutací v cDNA, umožňuje vyhledávat mutace v celé kódující oblasti genu NF1.: 1. Izolace RNA z krve nebo tkáně. 2. Přepis RNA zpětnou transkriptázou (RT) do cDNA. 3. Amplifikace vnitřní kódující oblasti cDNA s deseti páry specifických primerů - vznik deseti částečně se překrývajících segmentů P1 - P10 pokrývajících celou kódující oblast genu NF1. 4. Mutační analýza segmentů P1 - P10 pomocí cDNA-SSCP. 5. Sekvenace vzorků s odlišnou elektroforetickou mobilitou. 6. Určení typu a polohy mutace. RT cDNA PCR NF1 cDNA ( 60 exonů) P1 P3 P5 P7 P9 P2 P4 P6 P8 P10 cDNA-SSCP (~ 1000 - 1200bp) Sekvenační analýza

12. Metoda jednořetězcového konformačního polymorfismu (SSCP) - technika založená na elektroforetické mobilitě jednořetězců DNA. Cílový produkt amplifikace DNA je tepelně denaturován na jednořetězce a je podroben elektroforetické separaci. Za nedenaturujících podmínek zaujímá ssDNA sekundární strukturu podmíněnou sekvencí nukleotidů. Přítomnost mutace tuto strukturu mění, tím je ovlivněna i rychlost migrace DNA a na gelu můžeme detekovat nadbytečný proužek.

13. P7 mt C5242T wt C62 cDNA/SSCP analýza genu NF1 Úspěšné zavedení SSCP analýzy (používané většinou pro úseky DNA do 300bp) pro úseky genu NF1 o délce okolo 1 kbp. - PCR produkt ředit ve formamidu - 10 % PAG (40:1) - elektroforéza: 600 V 15°C 4,5 h podmínky elektroforetické separace : 12% PAGE (60:1) / 150V / 16 hod. / r.t.

14. Sekvenace úseku P7 genu NF1 ( exony 28 - 33) mutantní DNA C 5242 T ( R 1748 X) Arg > Stop 5’ 3’ C > T standardní DNA 5’ 3’

15. Další kroky v diagnostice neurofibromatóz - zavedení funkční analýzy proteinového produktu genu NF1, (rozlišení neutrálního polymorfismu od mutaci způsobující změny) - objasnění souvislosti konkrétní mutace a formy postižení - genová terapie, cílená terapie(viz obr.): a) blokování enzymů zapojených do farnesylace ras b - d) blokování dalších cílů aktivovaných proteinem ras pro amplifikaci mitogenního signálu - zavedení diagnostiky neurofibromatózy typu 2 na našem pracovišti a b c d

16. Závěr V souboru 30 pacientů vyšetřovaných RNA diagnostikou (cDNA/SSCP) byla nalezena změna v mobilitě některého z fragmentů P1 - P10 cDNA u 17 pacientů. U 6 z nich byla mutace na úrovni cDNA přesně charakterizována (jedná se o tři delece celých exonů, jednu deleci čtyř nukleotidů a dvě nukleotidové substituce). U ostatních je třeba sekvenací dořešit, zda je změna v mobilitě úseku cDNA způsobena skutečně mutací a tuto případnou mutaci přesně charakterizovat. Pro potvrzení patologického vlivu nalezených mutací na funkci proteinu by bylo vhodné zavést funkční analýzu neurofibrominu v kvasinkách (FASAY).