无菌医疗器械的检验

1. 无菌医疗器械的检验 杭州市药品检验所 杭州市医疗器械检验所 医械&生测室 茅纯

2. 概述 无菌医疗器械是临床上应用最为广泛的无源医疗器械，其生物、化学性能直接关系到临床应用安全的指标，因此，要保证患者的安全，就必须保证产品有良好的生物相容性和稳定的化学性能及较少的化学溶出物质。

3. 无菌医疗器械的检验 • 理化检验 • 生化检验 另：洁净区（室）的检测

4. 理化检验 • 物理项目 • 化学项目

5. 理化检验—通则（14233.1） • 所有分析均应以两个平行试验组进行,结果应在允许相对偏差范围内,以算术平均值为测定结果，如一份合格，另一份不合格，不得平均计算，应重新测定 • 若无特殊规定,所用试剂均为分析纯 • 若无特殊规定,试验用水均应符合GB/T 6682-2008中二级水的要求 • “室温”指10 ℃ ～ 30℃

6. 理化检验—通则（14233.1） • “精确称重”指称重精确到0.1mg • “精确量取”指用符合相应国家标准规定的准确度要求的移液管量取 • 重量法恒重系指供试品连续两次炽灼或干燥后的重量之差不得超过0.3mg • 若无特殊规定，所用玻璃容器均为硅硼酸盐玻璃容器

7. 理化检验—基本表述 环境温度 室温： 10 ℃ ～ 30℃ 常温： 15 ℃ ～ 25℃ 注：若未说明，则指在室温下进行实验

8. 理化检验—基本表述 水浴温度 沸水浴：100℃ 冰浴： 0℃ 注：若未说明，则水浴即指沸水浴

9. 理化检验—基本表述 称量的精度范围 根据数值的有效数字来确定（四舍六入） 例： 称取 1.00g，即为0.995～1.005g 称取 1.0g，即为0.95 ～1.05g 称取 10g，即为9.5 ～10.5g

10. 理化检验—基本表述 溶液的百分含量 溶质为固体，则为w/v 溶质为液体，则为v/v 例： 0.9%Nacl溶液，指100mL溶液中含0.9gNacl 75%乙醇溶液，指100mL溶液中含75mL乙醇 （1 → 10），即指10%溶液 注：未说明溶剂种类时均指水

11. 理化检验—检验内容 • 检验液溶出物的检验 （注意区分各种样品的检验液制备方法，见GB/T 14233.1—2008） 37±1℃的恒温箱要定期做温度校准，并确保温度波动符合要求 • 材料的检验

12. 理化检验—检验内容 检验液溶出物的检验： 浊度和色泽、还原物质（易氧化物）、氯化物、酸碱度、蒸发残渣、重金属总含量、紫外吸光度、铵、部分重金属元素

13. 理化检验—检验内容 材料的检验： 重金属总含量、部分重金属元素含量、炽灼残渣、环氧乙烷残留量

14. 理化检验—影响结果的因素 1、还原物质（易氧化物）: • 原料中的增塑剂（DOP）中含有醇,而醇的还原性比较强； • 环氧乙烷（EO）处理不干净,EO转化为醇; • 环己酮用量过大; • 注射件及胶塞,在加工过程中若工艺控制不当,其材料和助剂（硫化剂,硫化促进剂,活性剂,补强剂,软化剂,着色剂,防老剂等）中的还原性物质易析出,影响还物质。

15. 理化检验—影响结果的因素 2、重金属（金属离子）:与热稳定剂及添加剂有关 3、pH值（酸碱度）: • 与原材料中的助剂及添加剂有关。 • 与灭菌方法有关: 若用辐射灭菌,辐射可使PVC塑料降解,分解出Hcl,从而使pH值偏低; 若用环氧乙烷灭菌,由于EO本身呈碱性,使得pH值偏高

16. 理化检验—影响结果的因素 4、不挥发物:与粒料中的残渣及其析出的油性、非油性不挥发性物质有关,与环境卫生有关。 5、紫外吸收:与原材料及助剂有关,与环己酮有关。 6、EO残留量: EO残留量的大小与材料、灭菌工艺的好坏有关。与包装材料的材质和季节、通风等有关。

17. 理化检验—检验工具 仪器（精密电子天平、紫外分光光度计、原子吸收分光光度计、原子荧光光度计、气相色谱仪）要定期检定，两次检定期间要进行期间核查 各类称量工具、玻璃器皿等要定期检定、校准

18. 理化检验—标准滴定液 GB/T 601 化学试剂 标准滴定溶液的制备 1.标准滴定液的浓度,除高氯酸外,均指20℃时的浓度,在标准滴定液标定、直接制备和使用时,若温度有差异,按GB601附录A补正。在标准滴定液标定、直接制备和使用时所用分析天平、法码、滴定管、容量瓶及吸管等均须定期校正。

19. 理化检验—标准滴定液 2.在标定和使用标准滴定液时, 滴定速度一般应保持在6mL/min-8mL/min（120-160滴）。 3.称量基准试剂的质量的数值小于0.5g时,按精确至0.01mg称量;数值大于0.5g时,按精确至0.1mg称量。 4.制备标准滴定液的浓度值应在规定浓度值的±5%范围内。

20. 理化检验—标准滴定液 5.标定标准滴定液的浓度时,须两人进行实验,每人做四平行,且四平行测定结果极差的相对值不得大于重复性临界极差的相对值0.15%,两人八平行测定结果极差的相对值不得大于重复性临界极差的相对值0.18%,取两人八平行测定结果的平均值为测定结果。注意,在运算过程中,保留五位有效数字,浓度值的报出结果取四位有效数字。

21. 理化检验—标准滴定液 6.标准滴定液的浓度平均值的扩展不确定度应不大于0.2%。 7.标准滴定液的浓度小于等于0.02mol/L时,应于临用前将高浓度的标准滴定液用煮沸并冷却的水稀释,必要时重新标定。

22. 理化检验—标准滴定液 8.除另有规定外, 标准滴定液在常温（15℃-25℃）下保存时间一般不超过两个月。当溶液出现浑浊、沉淀、颜色变化等现象时,应重新配制。 9.储存标准滴定液的容器,其材料不应与溶液起理化作用,壁厚最薄处不小于0.5mm。

23. 理化检验—标准滴定液 10.一般用工作基准试剂标定标准滴定液的浓度。当对标准滴定液的浓度值有更高要求时,可用二级纯度标准物质或定值标准物质代替工作基准试剂进行标定或直接制备,并在计算标准滴定液的浓度值时,将其质量分数代入计算式中。

24. 生化检验 • 无菌 • 细菌内毒素 • 动物试验等

25. 生化检验—无菌 器具灭菌方式 干热灭菌：160℃，2小时或180℃，1小时 湿热灭菌：121 ℃，15分钟

26. 生化检验—无菌 1. 器具灭菌 1.1 移液管放于不锈钢筒内或牛皮纸袋内，灭菌备用。 1.2 试管、离心管、三角瓶等在管(瓶)口塞上硅胶塞或纱布棉塞，塞子应塞进管口内2/3处，用牛皮纸将管口包扎紧，灭菌备用。

27. 生化检验—无菌 1.3 将注射器、针头配对，检查针头是否畅通后，将注射芯、管和针头分别放在双层纱布(或布)内，包扎严密，置带盖容器(如铝制饭盒)内，盖严，用灭菌袋或牛皮纸包扎好后，灭菌备用。 1.4 无菌衣、裤、帽、口罩等洗净晾干，配套，用灭菌袋或牛皮纸包严，湿热灭菌备用或使用一次性的无菌物品。

28. 生化检验—无菌 2. 培养基的准备 2.1 培养基的制备 • 硫乙醇酸盐流体培养基用于培养好氧菌、厌氧菌，改良马丁培养基用于培养真菌。 • 一般采用商品脱水培养基，临用时按照使用说明书进行配制，需注意培养基的PH值应符合规定，否则必须校正后，灭菌使用。 • 制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用。若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。

29. 生化检验—无菌 • 对于硫乙醇酸盐流体培养基，在供试品接种前，其氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5。否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。无菌试验培养时间结束时，氧化层高度不得超过培养基深度的1/2。 • 2.2 培养基的无菌性检查 • 临用前须对配制好的培养基进行无菌性检查，每批培养基随机取不少于5支（瓶），培养14天，证明无菌生长后方可使用。

30. 生化检验—无菌 2.3 培养基灵敏度检查 • 2.3.1 标准菌株 • 金黄色葡萄球菌 CMCC（B）26 003 • 铜绿假单胞菌 CMCC（B）10 104 • 枯草芽孢杆菌 CMCC（B）63 501 • 生孢梭菌 CMCC（B）64 941 • 白色念珠菌 CMCC（F）98 001 • 黑曲霉 CMCC（F）98 003 标准菌株每月需传代一次，不得使用五代后的菌株 浙江省食品药品检验所提供

31. 生化检验—无菌 2.3.2 菌液制备 • 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30-35℃培养18-24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，23-28℃培养24-48小时；上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每lmL含菌数小于100cfu的菌悬液。 • 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23-28℃培养5-7天，加入3-5ml0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1mL含孢子数小于100cfu的孢子悬液。

32. 生化检验—无菌 2.3.3 培养基灵敏度检查 • 取每管装量为12mL的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天； • 取每管装量为9mL的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。 • 逐日观察结果并记录。空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。

33. 生化检验—无菌 3. 无菌室要求 无菌医疗器械生产企业应将微生物检测作为检测工作的重点，而微生物实验室承担着灭菌验证、环境监控、产品放行等一系列重要工作，所以说无菌医疗器械生产企业拥有一个微生物实验室是十分必要的 。微生物实验室应满足无菌实验对工作环境的要求，环境洁净度10000级，无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度100级单向流空气区域要求。

34. 生化检验—无菌 • 无菌室分缓冲间和无菌操作室。缓冲间及操作室内均设置照明灯和紫外灯，在缓冲间内应有洗手盆、无菌衣裤放置架或挂钩等。无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流动装置，局部洁净度100级或放置同等级别的超净工作台（或生物安全柜），工作台内应准备好酒精灯、打火机、镊子、剪刀、75%酒精棉等。 • 无菌室应在每周和每次操作前用75%(V/V)乙醇或0.1%新洁尔灭或其他适宜消毒液擦拭工作台面及可能污染的死角，开启无菌空气过滤器及紫外灯1小时。在每次操作完毕，同样使用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌应不少于半小时。

35. 生化检验—无菌 • 应定期检查工作台面空气菌落数，方法如下：取直径约90mm培养皿，无菌操作注入融化的胰酪胨大豆琼脂培养基约20mL，在30℃-35℃培养48h证明无菌后，取3只培养皿在无菌室操作台或超净工作台平均位置打开上盖，暴露 30min后盖好，置30℃-35℃培养48h后取出检查。3只培养皿上生长的菌落数平均应不超过l个（100级清洁度要求）。 • 无菌试验过程中应检查空气中的菌落数，方法同上。在试验开始进行时打开培养皿盖，至试验结束后盖好，按照上法培养，应符合上述要求。

36. 生化检验—无菌 • 无菌操作台或超净工作台洁净度应达到100级； • 温度为18℃ ～ 28℃ ； • 相对湿度为45% ～ 65% ； • 垂直层流风速≥0.3m/s , 水平层流风速≥0.4m/s； • 不同级别洁净区及洁净区之间的静压差≥5Pa, 洁净区及室外之间的静压差≥10Pa ； • 粒径≥5µm的尘粒数不得存在，≥0.5µm的尘粒数≤3500个/m3； • 细菌沉降菌数平均≤1cfu/皿

37. 生化检验—无菌 4.试验前准备 • 培养基在移入缓冲间前应先编号，并用0.1%新洁尔灭或(V/V)酒精棉等擦拭瓶(管)外壁，然后连同其他用具(包括无菌衣、帽、口罩等) 移入缓冲间；供试品移入前，外包装须进行消毒处理。 • 操作人员用肥皂、自来水洗双手，关闭紫外灯，进入缓冲间，换拖鞋，再用75%(V/V)酒精棉等擦手，穿戴衣、帽、口罩。将所需物品剥掉牛皮纸，移入无菌操作室，准备进行实验。每次实验所用物品必须计划好，并有备用物。

38. 生化检验—细菌内毒素 细菌内毒素的概念： 细菌内毒素（Endotoxin）是革兰氏阴性菌的细胞壁成分。细菌在生存状态时不具有毒性，只有当细菌死亡，细胞壁溶解后才表现其毒性。内毒素的主要化学成分是细胞壁中的脂多糖。

39. 生化检验—细菌内毒素 细菌内毒素的理化性质 1 耐热性：干热灭菌250℃至少1小时可完全破坏 2 滤过性：体积极小，可通过普通滤器 3 水溶性：可溶于水，生产中可用无热原水冲洗以除去热原 4 不挥发性 5 易被吸附（树脂、玻璃等） 6 易被酸碱破坏 7 易被氧化剂破坏：30%双氧水浸泡4小时，可完全破坏

40. 生化检验—细菌内毒素 细菌内毒素的检查方法 • 凝胶法 • 光度测定法 供试品检测时，可使用其中任何一种方法 当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准

41. 生化检验—细菌内毒素 凝胶法的优点： • 科学性：有生物化学的理论基础。 • 准确性：是酶的分子生化反应，专属性高，重现性强。 • 灵敏性：鲎试剂和细菌内毒素的反应灵敏度极高，当内毒素量低到10-10g/ml浓度，它们都能起凝胶反应，至今未发现一种物质对鲎试剂的反应比细菌内毒素更灵敏。 • 实用性：方法快速，操作简单，无需特殊仪器设备，经济实用。

42. 生化检验—细菌内毒素 试验前的准备 • 玻璃器皿均需250℃干热灭菌1小时 • 移液枪的枪头须是无热原的 • 内毒素标准品、鲎试剂、BET水均需冷藏保存

43. 生化检验—细菌内毒素 操作注意事项： • 溶解细菌内毒素标准品时须在旋涡混合器上混合15分钟 • 每一步稀释均须在旋涡混合器上混合30秒 • 37℃恒温60分钟期间应避免震动

44. 生化检验—细菌内毒素 鲎试剂灵敏度的检查 • 内毒素标准品溶液的制备 取内毒素标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。 按标准品使用说明书用移液管加入规定量的BET水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准溶液即2.0λ、1.0 λ,0.5 λ, 0.25λ（λ为所复核鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒

45. 生化检验—细菌内毒素 例： 使用中检院的内毒素标准品(160EU/支)时的方法如下： 溶解：准确吸取BET水1ml加入标准品的安瓿内，用封口膜将口封严，置旋涡混合器混合15分钟，即为160EU/ml的内毒素标准溶液。

46. 生化检验—细菌内毒素 稀释：取0.1mL内毒素标准溶液加上1.5mL BET水即得10EU/mL的内毒素标准溶液；再取0.2mL，加1.8mL BET水即得1EU/ml的内毒素标准溶液，往后依次类推。

47. 生化检验—细菌内毒素 在制备内毒素标准溶液的同时，取0.1ml/支的鲎试剂18支轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底。用砂轮在瓶颈处轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开备用，加入0.1mlBET水，使鲎试剂充分溶解，避免产生气泡。

48. 生化检验—细菌内毒素 将已充分溶解的待复核鲎试剂18支(管)放在试管架上，排成5列，其中4支(管)4列分别加入2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液；2支(管)1列分别加入 BET水，作为阴性对照。内毒素标准溶液和BET水加样量均为0.1ml/支。

49. 生化检验—细菌内毒素 加样结束后，用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37摄氏度水浴中，试管架保持水平状态，保温60±2分钟.

50. 生化检验—细菌内毒素 结果判定： 将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转180°时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（＋）；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）。