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PATTERN, MOTIVI E PROFILI IN ACIDI NUCLEICI

PATTERN, MOTIVI E PROFILI IN ACIDI NUCLEICI. REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA PATTERN DISCOVERY IN SEQUENZE PROMOTORIALI PER LA RICERCA DI NUOVI ELEMENTI FUNZIONALI. PATTERN, MOTIVI E PROFILI IN ACIDI NUCLEICI. REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA

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PATTERN, MOTIVI E PROFILI IN ACIDI NUCLEICI

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  1. PATTERN, MOTIVI E PROFILIIN ACIDI NUCLEICI • REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA • PATTERN DISCOVERY IN SEQUENZE PROMOTORIALI PER LA RICERCA DI NUOVI ELEMENTI FUNZIONALI

  2. PATTERN, MOTIVI E PROFILIIN ACIDI NUCLEICI • REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA • PATTERN DISCOVERY IN SEQUENZE PROMOTORIALI PER LA RICERCA DI NUOVI ELEMENTI FUNZIONALI

  3. REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA ESPRESSIONE DEL GENOMA UMANO NELLE CELLULE DIFFERENZIATE • Tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso corredo genomico (~40000 geni) • L’espressione genica tessuto specifica determina il fenotipo morfo-funzionale dei tipi cellulari e tissutali • In ogni cellula differenziata ed in ogni particolare momento dello sviluppo e’ attivo solo un sottoinsieme di geni

  4. REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA Restrizione spaziale e temporale dell’espressione genica • Geni housekeeping • Geni con espressione ristretta nello spazio • Espressione in piu’ organi/tessuti diversi Stesso ruolo in piu’ tessuti Il gene codifica per diverse isoforme (promotori alternativi e/o splicing alternativo tessuto specifico) • Espressione specifica per tessuto, linea o tipo cellulare • Espressione solo in singole cellule • Distribuzione intracellulare o extracellulare • Geni con espressione ristretta nel tempo • Stadio di sviluppo • Stadio di differenziamento • Momento del ciclo cellulare • Espressione inducibile da parte di fattori ambientali o extracellulari

  5. REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA DNA Pre RNA mRNA PRIMARY TRANSLATION ACTIVE PROTEIN

  6. REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA Negli Eucarioti superiori si svolge pricipalmente come controllo della trascrizione Puo’ agire su ciascuno dei livelli che caratterizzano il passare dell’informazione genica dal DNA alle proteine • INIZIO DELLA TRASCRIZIONE • La RNA polimerasiriconosce l’inizio del gene. Viene diretta • sul TSS (Transcription Start Site) sulla base della sua affinita’ per • la specifica sequenza upstream al gene, ovvero il promotore. La • doppia elica viene aperta dove inizia la sintesi del messaggero. • 2 steps • I TF legano la sequenza promotrice (e gli enhancers) formando un complesso multiproteico • Il complesso recluta la pol II complessata ad alcuni GTF e questa si lega al promotore core

  7. REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA POL II PROMOTER ELEMENTS TSS (vicino alla regione Initiator) + sito di legame per un GTF (spesso TBP) CORE PROMOTER ELEMENTS • TATA box • Initiator • Downstream promoter element TRANSCRIPTION FACTORS (TF) BINDING SITES • CAAT box • GC box • Sp-1 sites • GAGA boxes ENHANCER(S) SITES

  8. REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA Assemblaggio del complesso attivatore della trascrizione sul promotore prossimale e sulla regione core

  9. Struttura schematica di un promotore per la Pol II PROMOTORE CORE  regione sufficiente a deteminare il TSS esatto PROM. PROSSIMALE  200-300 bp upstream al TSS, responsabile, almeno in parte, della modulazione dell’espressione PROMOTORE DISTALE  100 bp – 2 Mb

  10. 4 possibili assetti di promotori core funzionali GENERAL CORE PROMOTER MODULE A C B D

  11. Sequenze nucleotidiche al 5’ del sito d’inizio della trascrizione di geni di E.coli trascritti attraverso il fattore housekeeping sigma70 della RNA polimerasi caaaacggttgacaacatga agtaaacacggtacgatgtaccacat aaagagtattgacttaaagt ctaacctataggatacttacagccat tggcggtgttgacataaata ccactggcggtgatactgagcacatc cgtgcgtgttgactatttta cctctggcggtgataatggttgcatg tgccgaagttgagtattttt gctgtatttgtcataatgactcctgt tctttttgatgcaattcgct ttgcttctgactataatagacagggt cattaacgtttacaatttaa atatttgcttatacaatcatcctgtt cgtcaggattgacaccctcc caattgtatgttttcatgcctccaaa aattgttgttgttaacttgt ttattgcagcttataatggttacaaa atgagctgttgacaattaat catcgaactagttaactagtacgcaa tgttgacaattt t t t tg tataatgc t • Due regioni in cui la sequenza e’ conservata: -10 - 35 dallo start site (motivi TTGACA e TATAAT) • IL TFIID e’ un complesso della TATA box binding protein (TBP) e di altre proteine chiamate TATA bindingprotein associated factors, o TAFs. • L’inizio della transcrizione puo’ essere studiato in vitro (DNA + proteine purificate). L’inizio della trascrizione da promotori TATA-containing non richiede necessariamente TAFs. • TAFs stimulate initiation from TATA-containing promoters that also have Inr's. • TAFs are required for initiation from TATA-less promoters.

  12. CONSENSUS SEQUENCE APPROACH TO THE IDENTIFICATION OF GENETIC SIGNALS • I motiviTTGACA and TATAATsono i segnali che vengono riconosciuti dalla subunita’ sigma70 della polimerasi. • La “forza” relativa di un promotore e’ proporzionale alla sua similarita’ ad una specifica sequenza consenso. • Mutazioni nelle regioni -10 and –35 alterano la “forza” del promotore. • Esperimenti tipo footprinting o methylation interference confermano la loro attivita’.

  13. GENETIC SIGNALS dobefmolecdaiularsqueihgensvweticskiprovsvillmmdescheplemolasusyretpb • Gli ELEMENTI SEGNALE generalmente agiscono solo sulle molecole di DNA di cui fanno parte ("cis-acting elements“) • Questi elementi segnale vengono “accesi” o “spenti” attraverso l’interazione con fattori di trascrizione • I fattori di trascrizione sono PROTEINE. In generale, sono proteine in grado di diffondere nelle cellule e in grado di interagire con elementi bersaglio che possono trovarsi in una qualsiasi molecola di DNA (“trans-acting factors”) dobefmolecdaiularsqueihgensvweticskiprovsvillmmdescheplemolasusyretpb molec ular gen etics pro vi des ple asu re

  14. ESEMPIO DI FATTORE DI TRASCRIZIONE MEF-2 (myocyte enhancer factor-2) PROTEINA DI 507 AA MGRKKIQITRIMDERNRQVTFTKRKFGLMKKAYELSVLCDCEIALIIFNSSNKLFQYASTMDKVLLKYTEYNEPHESRTNSDIVEALNKKEHRGCDSPDPDTSYVLTPHTEEKYKKINEFDNMMRNHKIAPGLPPQNFSMSVTVPVTSPNALSYTNPGSSLVSPSLAASSTLTDSSMLPPQTTLHRNVSPGAPQRPPSTGNAGGMLSTTDLTVPNGAGSSPVGNGFVNSRASPNLIGTGANSLGKVMPTKSPPPPGGGNLGMNSRKPDLRVVIPPSSKGMMPPLSEEEELELNTQRSSSQATQPLATPVVSVTTPSLPPQGLVYSAMPTAYNTDYSLTSADLSALQGFNSPGMLSGQVSAWQQHHLGQAALSSLVAGGQLSQGSNLSINTNQNISIKSEPISPPRDRMTPSGFQQQQQQQQQQPPPPPQPQPQPPQPQPRQEMGRSPVDSLSSSSSSYDGSDREDPRGDFHSPVLGRPPNTEDRESPSVKRMRMDAWVT

  15. DATI NOTI: SEQUENZE REGOLATIVE IN GRADO DI LEGARE MEF-2 UPSTREAM AD ALCUNI GENI REGOLATI DA MEF-2 muscle-type creatine kinase (-1091 –1062) ... ggaggagaagctcgctCTAAAAATAAccct ... alpha-myosin heavy chain (-340 -313) ... cagaTTAAAAATAActaa ... myogenin (-131 –15) ... gcagccggacaagttttgatgcgaggcagcagcttagggtgggct aggtttcctttaggttttctatatttatctctgtgatttaatgccagcgccgg ggtttaaatggcaccgag ... ... Evidenze: DNase I footprinting, direct gel shift, supershift (antibody binding) e methylation protection

  16. MATRICE DI MEF-2 POS. A C G T 01 5 28 25 42 N 02 16 32 31 21 N 03 18 36 27 19 N 04 19 25 33 23 N 05 22 12 43 23 N 06 33 9 21 37 N 07 20 4 43 33 K (G o T, Keto) 08 3 85 3 9 C 09 3 8 0 89 T 10 85 0 0 15 A 11 57 0 0 41 W (A O T, Weak) 12 91 0 1 8 A 13 96 0 0 4 A 14 93 0 1 6 A 15 0 0 0 100 T 16 100 0 0 0 A 17 9 0 90 1 G 18 34 46 11 9 M (A o C, Amino) 19 36 28 8 28 N 20 20 37 15 28 N 21 30 34 13 23 N 22 23 23 22 32 N SEQUENZA CONSENSO LEGANTE MEF-2: NNNNNNKCTAWAAATAGMNNNN

  17. METODO SEQUENZE UPSTREAM ALLINEAMENTO LOCALE ANALISI DELL’ALLINEAMENTO PATTERN DISCOVERY MOTIVO

  18. http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/index.html TRANSFAC

  19. TRANSFAC

  20. MODELLO DI ORGANIZZAZIONE DI UN PROMOTORE COMPLESSORANTES/CCL5 - chemokine – inflammation Promoter characterized

  21. PATTERN, MOTIVI E PROFILIIN ACIDI NUCLEICI • REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA • PATTERN DISCOVERY IN SEQUENZE PROMOTORIALI PER LA RICERCA DI NUOVI ELEMENTI FUNZIONALI

  22. PATTERN DISCOVERY IN SEQUENZE PROMOTORIALI PER LA RICERCA DI NUOVI ELEMENTI FUNZIONALI • Sono disponibili le sequenze di molti genomi interi • Per diversi organismi procariotici ed eucariotici virtualmente tutti i geni sono noti o predetti • Informazioni funzionali ancora parziali: • regolazione espressione genica • funzione proteine • L’analisi di singoli promotori con i metodi tradizionali e’ molto lenta e dispendiosa, non “scaled up” alla quantita’ di dati disponibili • Applicazione di metodi di “PATTERN DISCOVERY” allo studio di sequenze regolative

  23. PATTERN DISCOVERY IN SEQUENZE PROMOTORIALI PER LA RICERCA DI NUOVI ELEMENTI FUNZIONALI Perche’ si possono applicare metodi di “PATTERN DISCOVERY” allo studio di sequenze regolative di geni ? E’ verosimile che: gruppi di geni espressi in modo simile (nel tempo, nello spazio) co-regolati ovvero che siano controllati da sottogruppi simili di fattori di trascrizione condividano almeno parte degli elementi regolativi cis-acting, cioe’ i segnali nelle sequenze promotoriali Pattern discovery  scoprire sottostringhe comuni tra piu’ stringhe (es. Sequenze di DNA) Problemi: I “segnali genetici” non sono pattern esatti ma approssimati Possono esserci o non esserci nelle sequenze analizzate

  24. PATTERN DISCOVERY IN SEQUENZE PROMOTORIALI PER LA RICERCA DI NUOVI ELEMENTI FUNZIONALI PATTERN MATCHING/RECOGNITION vs PATTERN DISCOVERY • PATTERN MATCHING trovare TUTTE le volte in cui uno specifico PATTERN esatto si presenta (occurences) in una stringa o in un insieme di stringhe (sequenze di DNA o aminoacidi) Es.: trovare il PATTERN “HHKHKK” in AMVOIBGJFDHHKHKKUUUPFIRJRNTMDHHKHKKHJHKKSAAW • PATTERN RECOGNITION  riconoscere le occurences approssimate di uno specifico PATTERN in una una stringa o in un insieme di stringhe Es.: trovare il PATTERN “HH*HKK” in AMVOIBGJFDHHKHKKUUUPFIRJRNTMDHHAHKKHJHKKSAAW

  25. PATTERN DISCOVERY IN SEQUENZE PROMOTORIALI PER LA RICERCA DI NUOVI ELEMENTI FUNZIONALI PATTERN MATCHING/RECOGNITION vs PATTERN DISCOVERY • PATTERN DISCOVERY  identificare PATTERN SIGNIFICATIVI in una stringa o in un insieme di stringhe senza conoscerli a priori Es.: trovare i PATTERN SIGNIFICATIVI in ATTCAGTCTTGTGCTTTTAGTCTCTTAGCTAGTCTCTAATTTAGACAGTCTA Uno puo’ essere: AGTCT, infatti: ATTCAGTCTTGTGCTTTTAGTCTCTTAGCTAGTCTCTAATTTAGACAGTCTA

  26. Quali siti potenzialmente leganti fattori di trascrizione si trovano sulla mia sequenza e dove sono localizzati ?Query: 250 bp upstream al gene per un canale Na+/Ca++ espresso nel muscolo e nel tessuto nervoso Approaches to pattern recognition

  27. Quali siti potenzialmente leganti fattori di trascrizione si trovano sulla mia sequenza e dove sono localizzati ?Tabella dei risultati Approaches to pattern recognition Sp1

  28. http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess

  29. Approaches to pattern discovery Pattern driven: • Enumerazione di tutti (o alcuni) dei possibili patterns fino a una certa lunghezza, per ciascun pattern si calcola un punteggio basato sulla frequenza e si scelgono i punteggi piu’ alti Non fattibile per pattern anche di dimensione modesta Sequence driven:  Ricerca dei pattern basata sull’allineamento delle sequenze

  30. Algoritmi pattern driven • I metodi "pattern driven" cercano in una sequenza specifiche classi di pattern e valutano la loro frequenza di apparizione. • Ilnumero di pattern possibili aumenta esponenzialmente con la lunghezza dell'input. Per pattern esatti, ad esempio, e' quadratico. • L'utilizzo diuna struttura di dati ad albero dei suffissi migliora l'efficienza del metodo e permette di trovare tutte le sequenze piu' (o meno) rappresentatedell'atteso in tempo lineare con la dimensione dell'input

  31. Algoritmi pattern driven Il problema e’ trovare pattern significativi, tra tutti i possibili pattern. I pattern sono sottostringhe. Considero tutti i possibili pattern lunghi 10 nucleotidi nella seguente sottostringa: AGTCTTGTGCTTTTAGTCTTGTGCCTAGTCTCTAATTTAGACAGTCT AGTCTTGTGC GTCTTGTGCT TCTTGTGCTT CTTGTGCTTTT TTGTGCTTTTA TGTGCTTTTAG GTGCTTTTAGT TGCTTTTAGTC GCTTTTAGTCT CTTTTAGTCTT TTTTAGTCTTG TTTAGTCTTGT TTAGTCTTGTG TAGTCTTGTGC AGTCTTGTGCC GTCTTGTGCCT ... Sono rappresentati tutti 1 volta, mentre la sottostringaAGTCTTGTGCC e’ rappresentata 2 volte. Voglio sapere se trovare una sottostringa lunga 10 rappresentata 2 volte e’ SORPRENDENTE.

  32. Algoritmi pattern driven Per calcolare quanto un fenomeno sia sorprendente ci si riferisce a quello che ci si aspetta, sotto un’ipotesi probabilistica. La frequenza attesa di una sottostringa dipende dalla composizione della stringa. se %G=%C=%A=%T=25% posso immaginare una sorgente casualeche crea delle stringhe in modo che la probabilita’ di osservare un certo nucleotide in una certa posizione e’ indipendente dalla sequenza precedentemente generata (Modello di Bernoulli) A ATGCTGT T sempre 25% G C Approccio enumerativo:  enumerare tutti i possibili pattern di una certa lunghezza contenuti in una stringa  calcolare la significativita’ statistica di ciascuno  prendere in considerazione i pattern piu’ significativi Pero’ esistono 410(1,048,574) possibili pattern lunghi 10 in un alfabeto di 4 nucleotidi

  33. Algoritmi pattern driven • Poiche’ il problema e’ computazionalmente complesso, sono stati introdotti approcci euristici per limitare il “search space”: • si cerca solo un sottogruppo di pattern and esempio imponendo restrizioni sulla posizione dei “mismatches” • si usano particolari strutture-dati che facilitano la ricerca Un Suffix Tree e’ una struttura-dati che permette di risolvere “agevolmente”molti problemi con le stringhe tree substrings tree-->|---mississippi m .. mississippi | |---i-->|---ssi-->|---ssippi i .. ississippi | | | | | |---ppi issip,issipp,issippi | | | |---ppi ip, ipp, ippi | |---s-->|---si-->|---ssippi s .. ssissippi | | | | | |---ppi ssip, ssipp, ssippi | | | |---i-->|---ssippi si .. sissippi | | | |---ppi sip, sipp, sippi | |---p-->|---pi p, pp, ppi | |---i p, pi Given the string `mississippi',`miss' is a prefix, `ippi' is a suffix, & `issi' is a substring. Note that a substring is a prefix of a suffix.

  34. Algoritmi pattern driven Verbunculus ANALYSIS OF MULTIPLE SEQUENCES: trova le parole sopra- o sotto-rappresentate in un gruppo di sequenze ANALYSIS OF MULTIPLE SEQUENCES: Enumera tutti i possibili pattern che ricorrono in almeno q sequenze, con emmutazioni, se m e’ la lunghezza del pattern Weeder

  35. Algoritmi sequence driven • Si basano su: • Raggruppamento di sequenze simili o “funzionalmente equivalenti” • Per ogni gruppo, ricerca di pattern comuni tra le sequenze • Raggruppamento di pattern simili e ripetizione dello step precedente fino a che rimane un solo gruppo • I metodi "sequence driven" lavorano combinando i risultati della comparazione a coppie di sequenze, con il fine di evidenziare le regionisimili. Il problema di enumerare tutti i possibili pattern con occorrenze non esatte e' piuttosto impegnativo, percio' molti programmi cercanosoluzioni "quasi ottimali" attraverso algoritmi euristici.

  36. LAVORO “SPERIMENTALE” ANALISI BIOINFORMATICA E COMPUTAZIONALE DELLE SEQUENZE DI DNA A MONTE DI GENIDIFFERENZIALMENTE ESPRESSI NELLA RETINA SCOPO IDENTIFICARE SEQUENZE REGOLATIVE ANCORA SCONOSCIUTE E DI SVILUPPARE NUOVI MODELLI DI REGIONIREGOLATIVE TESSUTO-SPECIFICHE METODI PREDIZIONE DI PROMOTORI RICERCA E SCOPERTA DI NUOVI PATTERNS

  37. < LAVORO “SPERIMENTALE” ANALISI BIOINFORMATICA E COMPUTAZIONALE DELLE SEQUENZE DI DNA A MONTE DI GENIDIFFERENZIALMENTE ESPRESSI NELLA RETINA DATI:SEQUENZE DI DNA A MONTE DI GENI RETINA-SPECIFICI >NM_000539.2 rhodopsin(opsin 2, rod pigment)(RHO)chr3:147548167-147549166 exons in upper case CCTTCAGACTGGAGTCCCCTGAAGGGTTCTGCCCCTCCCCTGCTCTGGTAGCCCCCTCCATCCTCCCTCCCTCCACTCCATCTTTGGGGGCATTTGAGTCACCTTTCTACACCAGTGATCTGCCCAAGCCACTGCTCACTTTCCTCTGGATAAAGCCAGGTTCCCCGGCCTAGCGTTCAAGACCCATTACAACTGCCCCCAGCCCAGATCTTCCCCACCTAGCCACCTGGCAAACTGCTCCTTCTCTCAAAGGCCCAAACATGGCCTCCCAGACTGCAACCCCCAGGCAGTCAGGCCCTGTCTCCACAACCTCACAGCCACCCTGGACGGAATCTGCTTCTTCCCACATTTGAGTCCTCCTCAGCCCCTGAGCTCCTCTGGGCAGGGCTGTTTCTTTCCATCTTTGTATTCCCAGGGGCCTGCAAATAAATGTTTAATGAACGAACAAGAGAGTGAATTCCAATTCCATGCAACAAGGATTGGGCTCCTGGGCCCTAGGCTATGTGTCTGGCACCAGAAACGGAAGCTGCAGGTTGCAGCCCCTGCCCTCATGGAGCTCCTCCTGTCAGAGGAGTGTGGGGACTGGATGACTCCAGAGGTAACTTGTGGGGGAACGAACAGGTAAGGGGCTGTGTGACGAGATGAGAGACTGGGAGAATAAACCAGAAAGTCTCTAGCTGTCCAGAGGACATAGCACAGAGGCCCATGGTCCCTATTTCAAACCCAGGCCACCAGACTGAGCTGGGACCTTGGGACAGACAAGTCATGCAGAAGTTAGGGGACCTTCTCCTCCCTTTTCCTGGATCCTGAGTACCTCTCCTCCCTGACCTCAGGCTTCCTCCTAGTGTCACCTTGGCCCCTCTTAGAAGCCAATTAGGCCCTCAGTTTCTGCAGCGGGGATTAATATGATTATGAACACCCCCAATCTCCCAGATGCTGATTCAGCCAGGAGCTTAGGAGGGGGAGGTCACTTTATAAGGGTCTGGGGGGGTCAGAACCC >NM_000172.1 guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha transducing activity polypeptide 1 (GNAT1)chr3:55664892-55665891 AAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCCAGGCACGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCAGATCACGAGGTCAGGAGACTGAGACCATCCTGGCTAACACGGTGAAACCCTGTCTTTACTAAAATACAAAAAAAGTAGCCCGACGTAGTGGCGGGCACCTGTTGTCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCTGGGAGGTGGAGCTTGCAGTGAGCTGAGATTGCGCCACTGCACTCCAGCCTGAGCAACAGAGCGAGACTCCATCTCAGAAAAAAAAAAAAAAAAGACACATACACCGAGGCACACAGAGCAGATATGCATGCCCACCACAGTCCGCTGGAAGCAGAGGACCTCCTTGGGGCAGCTCCAGCCTGTGATATGGGATGAATGCAATGCCCACTGTTTCCCTCTCTCTGGATTCCCTGCAGGTCATAAAATCCCAGTCCAGAGTCACCAGCCCTTCTTAACCACTTCCTACTGTGTGACCCTTTCAGCCTTTACTTCCTCATCAGTAAAATGAGGCTGATGATATGGGCATCCATACTCCAGGGCCAGTGTGAGCTTACAACAAGATAAGGAGTGGTGCTGAGCCTGGTGCCGGGCAGGCAGCAGGCATGTTTCTCCCAATTATGCCCTCTCACTGCCAGCCCCACCTCCATTGTCCTCACCCCCAGGGCTCAAGGTTCTGCCTTCCCCTTTCTCAGCCCTGACCCTACTGAACATGTCTCCCCACTCCCAGGCAGTGCCAGGGCCTCTCCTGGAGGGTTGCGGGGACAGAAGGACAGCCGGAGTGCAGAGTCAGCGGTTGAGGGATTGGGGCTATGCCAGCCCGATTAGAAGGGTTGGGGGGGCTGAGCTGGATTCACCTGTCCTTGTCTCTGATTGGCTCTTGGACACCCCTAGCCCCCAAATCCCACTAAGCAGCCCCACCAGGGATTGCACAGGTCCGTAGAGAGCCAGTTGATTGC >NM_021200.1 PH domain containing protein in retina 1 (PHRET1) chr11:78311616-78312615 CACAAAGAAATGTAAAAGTTACTTGTTGGCTTATTAGTCTCAATAAGTTTTAGTTGATTGAACAAACAAAGTCTCTCACAGCCAGGACTGCTGCGGCTGGAATTCCTGACATACTGTCATACCTCTCACTCGTCAATCTACACTCTCCTCCCATCTACACAGCTCTGGAAATTAAAAACAATCCAACCATGACTATCATGGCTTCAGAGGTCTATGAACTCCCAGGAATTATACGCAGATTTTTTCCTGAGGACAGTCTACACTTCCTTATTGGCTTCTCAAAGAGGGTCACTGACCAGCTTTTAGAGACATGGGCCAAGTCCGGCTACGTTTAGATTCGGTAGTAGTGTCTGTGGTTTTAGTTTGCCACGTCCTTTCCTCTTTTTTTCGTCATAGTGCCCGCTCTTTGGGAGGTAGGGGAGAGTCTTCCCCTGAAGTCTCCACTGCTGCTGGAGAACCTTCCTTTTTCATCTGGTTGCTAAATCCAGAGAATGAAATCTAGGAGATGATTGCACCGTCCCCGCCCCTCAACATGAAGGATGCCCCACTGCCCATCGGGGAGGGGAGCAGGGAGAGCTGGAGAGAGGCTGGGTCGGGGCAGGACCCAGGCGCAGATCCTCCGAGGCCAGCTGCAGCCCTACCTACCTGCCTTCCCCTCTTTCCCCTCCCTTCTTTTCTCCTTCTGTCTTTCCTTCCTTCCATATCTCTTTCCTTGCCTCTTTCCCCCTCCCACTGCTTCCTTTCTTCCTTCCACTGTGGAGGTGGAAAATTTAGCTAGGAGAAGCTGGGACTGGGACGTTCCAGGAACCAGACAGAGAGTGAGTTAAAGGCACAGAGATGAAAACGCGGTTTGGGAGAGCTGGTTCTTGAGTCGGCTAAGAGGGGATGAACTCAATGGTTAATAGGATTGGCCATGGCGAATCCCTCAGCAGGGCACGCACCGCACAAAGGGCCGAAGCGCGAGGGTAGCTCGAGGTCAGGATTACAGAGACTCAGGAGC

  38. MEME

  39. Gibbs Sampler Teiresias SPLASH Cerca "parole" non-degenerate, sovrarappresentate in un gruppo di sequenze (positive set) rispetto ad un gruppo di controllo(negative set) Saco Patterns

  40. LIMITI DEI PROGRAMMI ESISTENTI: • DISPONIBILITA’ DEL SOFTWARE • POSSIBILITA’ DI REGOLARE I PARAMETRI DI RICERCA • LENTEZZA • NON FUNZIONAMENTO PER LA RICERCA DI PATTERN MEDIO LUNGHI E CON ALCUNE WILDCARDS • INCAPACITA’ DI TROVARE SEGNALI RAPPRESENTATI IN UNA FRAZIONE NON MAGGIORITARIA DELLE SEQUENZE INPUT • ESPLOSIONE DELL’OUTPUT • OUTPUT “ILLEGGIBILE”

  41. IL “CHALLENGE PROBLEM” Trovare un segnale lungo 15 nucleotidi con 4 wildcards (15-4) in 20 sequenze tutte contenenti un’istanza del segnale stesso. Performances dei diversi programmi:

  42. IL “CHALLENGE PROBLEM” Trovare un segnale lungo 15 nucleotidi con 4 wildcards (15-4) in 20 sequenze tutte contenenti un’istanza del segnale stesso. Performances dei diversi programmi: Sostanzialmente una frazione molto piccola dei segnali viene ritrovata e questa frazione tende a zero non appena la lunghezza delle sequenze in analisi supera il centinaio di basi.

  43. COMPLESSITA’ REALE DEL PROBLEMA: • La lunghezza delle sequenze promotoriali varia da 300 a 2000 paia di basi a seconda del gene e del fatto che si consideri il promotore core, quello prossimale o anche quello distale. • I segnali non sono pattern esatti. • Non tutti i promotori di geni presumibilmente coregolati contengono il medesimo segnale. E’ NECESSARIO FARE RICORSO ALLE CONOSCENZE BIOLOGICHE PER FILTRARE L’INPUT E L’OUTPUT DI PROGRAMMI DI PATTERN DISCOVERY: • ANALISI SU LARGA SCALA DELLE MATRICI DI TRANSFAC • UTILIZZO DI SIMULAZIONI • MASCHERAMENTO DELLE SEQUENZE ???

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